Summary
このモデルシステムは、非破壊における内因性コラーゲン（再）組織実時間を研究するために使用することができる筋線維芽細胞にポピュレートフィブリンゲルから始まる。モデル系は、それが別のセルソース、媒体添加剤と共に使用することができるように、非常に可変であり、特定のニーズに容易に適合させることができる。
Abstract
コラーゲン組織の開発におけるコラーゲン含有量と組織を局所組織系統および組織制約によって影響され得る。ティッシュエンジニアは、あらかじめ定義されたコラーゲンアーキテクチャと組織を作成するために、これらの原則を使用することを目指します。しかしながら、最終的な組織構造を制御するためのコラーゲンリモデリングの正確な基礎プロセスの完全な理解が欠けている。具体的には、少しは、組織の機械的荷重条件の変化に応じてコラーゲン線維の（再）配向について知られている。私たちは、さらにコラーゲンを解明するために、二軸に制約の筋線維芽細胞シードフィブリン構造から成る、in vitroモデル系で開発された私に反応して（再）配向）一軸静的荷重条件及びiiに軸戻す）二軸に制約の巡回一軸負荷はのFlexCell FX4000Tローディング装置の使用と、方向をロードに変更前と後のコンストラクト。タイムラプス共焦点イメージングはviに使用されます非破壊的にコラーゲン（再）配向sualize。
コンストラクトの細胞とコラーゲン組織がリアルタイムで可視化することができ、内部リファレンス·システムは、私たちが時間経過解析のための細胞とコラーゲン構造を再配置することができます。モデル·システムの様々な態様は、細胞源又は健康と病気の細胞の使用のように、調整することができる。添加剤はさらに、例えばMMPの追加やインテグリンを遮断することによって、コラーゲンの再構築のメカニズムを解明するために使用することができる。構築物の形状や大きさを容易に細胞およびコラーゲン（再）組織を研究するための高度に調整可能なモデル系で、その結果、特定のニーズに適合させることができる。
Introduction
心血管組織が目立つ耐荷重機能を持っています。細胞外マトリックス中のコラーゲン線維の特定のコンテンツと、組織内の耐荷重特性に寄与し、全体的な組織強度1を支配する。組織工学において、構築物の機械的調整が使用されている-典型的には（環状）緊張レジメンから成る-組織組織と機械的性質2,3を向上させることができる。事前定義されたコラーゲンのアーキテクチャを持つ組織を作成するために複雑な組織ジオメトリのひずみ誘起コラーゲン組織の完全な理解は、まだ達成されていません。これは、開発組織におけるコラーゲンリモデリングの我々の限られた知識によるものである。既存のモデルは、主に静的なひずみ4-6の使用とコラーゲンリモデリングの最終的な正味の結果に関する情報を与える。ここでは、影響を受けて、3Dで、リアルタイムの方法でコラーゲン（再）組織の研究を可能にする高度にチューニングモデルシステムを提供静的または環状株の。組織構造は、構造内のすべてのコラーゲンが内因性であることを保証する、フィブリンベースです。コンストラクトの細胞とコラーゲン組織が可視化され、内部リファレンス·システムは、私たちが時間経過解析のための細胞とコラーゲン構造を再配置することができます。これらの細胞は基づいて強化された細胞外マトリックス産生およびエンジニアリング心血管組織7マトリックス、当社設立の使用を改造する能力で知られていますので、このプロトコルでは、人間の伏在静脈細胞（HVSCs）のためのモデルシステムの使用を説明します8デヨングらの作業に
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Protocol
1。ヒト伏在静脈細胞の培養
- 9。シュネルらのプロトコールに従って、二次利用の材料のためのガイドラインに従ったドナーから取得した伏在静脈マグナから細胞を分離し、液体窒素中で、これらを保存する。 6ウェルプレートでの培養に2×2mmの1ドナー切断片から伏在静脈マグナの一部から。ウェルあたり2枚を使用してください。一般に十分な細胞を液体窒素中で0.25×10 6細胞を約3バイアルを充填するために得ることができる。 HVSCsはビメンチン、デスミンの発現およびα平滑筋アクチン10を表現する集団の発現を示すことによって、筋線維芽細胞として特徴付けられる。次に進む細胞数を増加させる液体窒素から細胞を解凍するためのプロトコルを開始する。
- T75組織培養フラスコに1バイアルからの細胞を配置し、アドバンストDMEM 50mlのウシ胎児血清（FBS）、5 mlのペニシリン/からなる増殖培地（GM）を加えるストレプトマイシン5mlのL-グルタマックス。 2〜3日ごとに培地を変更します。
- 細胞は約14日後にコンフルエントに成長。継代1と呼ばれる液体窒素で1バイアルに保管0.5×10 6細胞、。
注：細胞の凍結がHVSCsを収穫するときには必要ありませんが、もっぱら貯蔵のために使用されます。
- T175組織培養フラスコに1バイアルからHVSCsを置き、GMを追加します。 2〜3日ごとに培地を変更します。細胞は約7日後にコンフルエントに成長。液体窒素で1バイアルに保管3×10 6個の細胞、通路2と呼ばれる。
- rollerbottleに1バイアルから細胞を配置し、GMを追加します。 2〜3日ごとに培地を変更します。細胞が約8日後にコンフルエントに成長。 One rollerbottleは約20〜30×10 6個の細胞が含まれています。通路6に培養細胞まで。細胞表現型が変化するかもしれないので、通路9よりも高く、通路のセルを使用しないでください。 2。フィブリンベースの組織構築のエンジニアリング
- 硬化剤（10:1）とエラストマーとを混合することにより、シリコーン接着剤を準備します。ベルクロの7×3mmの長方形のセグメントをカットします。クロスを形成する、とベルクロストリップ間3mmの二乗のスペースを残して柔軟性のある膜を有する6ウェル培養プレートに接着剤はベルクロ、。
- 接着剤の硬化を保証するために60°Cのオーブンで一晩シリコーン接着剤を乾燥させる。 30分間インキュベートし、ウェルに70％エタノールを加えることによって滅菌する。 PBSで3回すすぎ、WELからすべてのPBSを削除lsコマンドとベルクロ。 30分間UV下に置き、使用するまで無菌に保つ。
- ティッシュエンジニアリングのGMから成る培地（TM）、およびL-アスコルビン酸2 - リン酸の130mgのを準備します。
- TMに1 mg / mlのε-アミノカプロン酸（ACA）を追加します。 ACAは、分解11からフィブリンを防止するために、培養の最初の7日間に使用される。あるいは、アプロチニンを使用することができる。
- 塊の形成を防ぐために、フィブリノゲン、開口前に室温に到達させる。塊のフィブリノゲンことなく、より簡単に溶解します。 ACAを補っ10mgを実際タンパク質/ mlのTM 7の濃度にフィブリノゲンを溶かす。無菌フィルターフィブリノゲン溶液、複数のフィルタが必要になることがあります。使用するまで氷上に保管してください。
- ACAを補った10 IU / mlのTM 7の濃度にトロンビンを溶かす。使用するまで氷上に保管してください。 </ OL>
- GMとカウントに再懸濁した細胞を、トリプシン処理。
- フィブリンベースの組織構造（組織工学心臓弁7のための方法に基づいて濃度）を播種するための15×10 6細胞/ mlを使用してください。シングルゲルは100μlのGOFエル、したがって1.5×10 6個の細胞で構成されています。説明するゲルの数と同数の遠心管をもたらす、ある遠心管に1.5×10 6細胞を入れた。
- 7分間350 xgで細胞を遠心し、上清を捨てる。 50μlのトロンビンで細胞を再懸濁します。この懸濁液に青色蛍光ポリスチレン微小球の4μLを加える。バイアルにフィブリノゲン液50μlを入れて。細胞を50μlのトロンビンを取るためにピペットを使用してください。 100μlにピペットの容積を大きくします。トロンビン50μlの溶液とをピペットトロンビンおよびフィブリノゲンを混ぜ、そして100μlの混合物を取るためにフィブリノゲンとバイアルへの細胞。
- へとベルクロストリップ間にゲル混合物をピペット。フィブリンゲルの典型的なゲル化時間は、一度成分が混合され、20秒程度である。
- ACAで培養TMを追加する前にゲル化を可能にするために加湿95％空気/ 5％CO 2インキュベーター内で37℃で30分間懸濁液をインキュベート。
- 最初の7日ごとに2〜3日は、ACAとTMを交換してください。ゲルはACAずに培養することが、一週間後には十分安定している。最初の週の後2〜3日ごとにTMを交換してください。ウェルあたりTM 6mlのを追加します。当日12細胞が可視化のために十分なコラーゲンを作り出した。
- 静的株は、細胞トラクションとコンパクション12により直接細胞によって適用される。コラーゲン再編を誘導するために、組織が一つの方向に2つのベルクロストリップから緩い構築カット。一方向の制約この結果（ 図1A）。構文はその後安定した十分で、コラーゲンが堆積されているので、12日目でこれを実行します。
- のFlexCell FX4000Tシステムを用いて、可撓膜と培養プレートの底部に真空を適用することにより、環状歪みを適用する。番目の一部であるローディングポスト（の上に、ベースプレートにプレートを置きます電子環状ローディング装置）。ポンプは膜に真空を適用することにより、下に横たわっている長方形のポストを介して膜を引っ張る。メンブレン（ベルクロを介して）組織構造の十字形添付ファイルや長方形のポストのために、適用された環状株は（ 図1B）一軸です。
- 当初、巡回ひずみの適用は6日目に開始する前に、初期の機械的完全性を達成するために5日間静置培養を使用しています。真空ポンプ用のコントローラにプログラムは、環状染色プロトコル。例えば一軸方向13で、以前に確立された断続的な巡回ひずみプロトコルを使用します。これは3時間休憩期間と交互に3時間の期間の0〜5％の株からいきみ1Hzの正弦波、、、の断続的な歪みから構成されています。整列コラーゲン組織を誘導、7日間この巡回ひずみプロトコルを実行します。
- 一般的に12日後にHVSCs、整列コラーゲンorganizatioを作り出したN。整列コラーゲン組織に到達した後、元の歪みの方向に対して垂直になるように、一軸環状歪み方向を変える。 90°長方形のポストを回してこれを行います。
- 細胞生存率またはコラーゲン形成を妨害しないプローブでアクティブなリアルタイムコラーゲンリモデリング、ラベルサンプルを可視化する。蛍光細胞質とコラーゲンを染色するためのプローブを使用します。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて或いは第二高調波発生は、780 nmおよび500〜550 nmの検出で励起し自家蛍光14を用いて、コラーゲン構造を可視化するために使用することができる。
- 3時間の休息期間中に周期的に緊張したサンプルについては、セットアップとインキュベーターから培養プレートを外し、細胞やコラーゲンを可視化するために共焦点レーザー走査顕微鏡にそれらを転送します。
注：のみベルクロのソフト面を使用し、この面を上に直面しています。とき接着ベルクロは、唯一のシリコーン接着剤でベルクロをカバー、うまく全体にのりを広げません。培養プレートは、シリコーン膜底を持っているので、プレートに簡単に接着を確保するために、柔軟性のある膜を補強するためのウェルプレートの下に何かを使用しています。
注：あまりにも多くの泡の形成を防止するために優しくフィブリノゲン混合物を溶解する。
注：氷上のストレージがトロンビンとフィブリノゲンの早期ゲル化を防ぐために必要とされる。
注 ：蛍光ポリスチレン微小球は、画像解析のための内部基準マーカとして使用される。トロンビンおよびフィブリノゲンを混合する際に、注意深く混合物をピペットで気泡の形成を防止する。気泡がフィブリンゲルの穴になります。
注 ：混合物をウェルプレートにピペットれる前にゲル化を防ぐために、できるだけ早くこれを行います。細胞やビーズを使用する前に練習。
3。ひずみと制約のひずみと誘導の変更の適用
4。可視セルとコラーゲン
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Representative Results
このモデルシステムは、筋線維芽細胞培養シードフィブリンゲルが可能になります。 図1Aは、静的軸制約の下で最初の培養組織を示しています。組織制約は、（ 図1A）、その後、一軸静的な制約を作成するために、2つの制約からフィブリンゲルを切断し、そして組織成形および改造によって解放される。環状株について、組織は同様に静的な二軸制約の下で培養する。 5日後に環状単軸ひずみが（ 図1B）を適用することができる。コラーゲンの再配向を誘導するために、一軸歪み方向が垂直方向（ 図1B）に変更することができる。ゲル混合物とミクロスシードは、タイムラプスイメージング（ 図2）のために事前定義された場所を再配置するために使用され、ランダムなパターンを表示します。 図2Aおよび2C細胞、コラーゲンやビーズのイメージを示す。これらの同じ画像は3日（FIGURスキャンされ後で、それぞれ電子2B）と2日間（ 図2D）。細胞とコラーゲンのパターンが変更されていますが、ビーズのパターンが細胞とコラーゲンを再配置するために使用されます。共焦点顕微鏡（ 図3および図4）で可視化されるのに十分な量の内因性のコラーゲン産生の12日間培養の結果のサンプル。軸静置培養がランダムコラーゲン組織（ 図3A）と整列コラーゲン構造（ 図4AおよびB）に二軸制約組織結果に適用一軸巡回ひずみを生じさせる明らかに異なるコラーゲン組織に静的または環状のいずれかで培養結果を使用。静的な制約を変更したり、環状の歪み方向を変化させながら、このコラーゲン組織は、経時的に研究することができる。静的な制約がランダム配向（ 図3Aから軸から一軸、コラーゲンの向きの変化に変更された場合）整列方向（ 図3B）へ。環状株は、組織の表面（ 図4AおよびC）の方位の変化を誘導するが、3日後に、組織のコアにおける変化は（ 図4BおよびD）観察されない。
図1。 （）一方向に、又は（B）を変化させる周期的な歪みの方向によって静的制約を放出することによって、コラーゲンを再編成するために使用される二軸制約の下で培養したコンストラクト。ローディングポストは黒い点線で示されている。スケールバーは、3mmを示している。
図2。静的この場合には、3Dで事前定義された位置を再配置するビードパターンの使用の典型的な例培養された試料。細胞を、赤、緑、青のビーズのコラーゲンに示されている。及びCは、細胞、コラーゲンとビーズのイメージを示す。これらの画像は、それぞれ、3日間（B）及び7日（D）遅くスキャンされる。ビーズパターンは細胞とコラーゲンを再配置するために使用されます。スケールバーは50μmであることを示します。
軸制約（）と7日以内に一軸制約のために方向転換して12日の静的ひずみの図3 R epresentative画像は、（B）。スケールバーは50μmであることを示します。
図4。表面で巡回株について12日後に代表的な画像（5日、静的、7日周期的歪みが続く）（）と〜60μmの組織（B）へ。巡回ひずみ方向（12日後）の変化した後、表面の細胞とコラーゲンで向きを変える（C）は変更が組織のコアに見られない（D）の後3日間。
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Discussion
細胞移入フィブリン構築物の記載モデル系は、細胞およびコラーゲンの研究のための大きな可能性を秘めている（再）組織（デ·ヨンゲら 15）、組織工学の目的で使用されるなど 。最初の細胞担体としてフィブリンを用いて、フィブリン分解した後、組織、細胞および内因性マトリックスのみを使用して作成される。この方法では、細胞は、境界剛性12、又は表示歪み回避を感知16,17の収縮力を印加することによって、本質的に静的または環状のいずれかの歪みに反応するように刺激される。
意義：コラーゲン（再）組織18を勉強する前に、フィブリン構造が使用されているではなく、周期的な歪みおよび/ を適用するか、この提示方法が可能であるどちらもタイムラプスの方法で構造体を研究する能力を持つ。このモデル系で制約を提供するベルクロストリップは、19の前に使用されているしかし、柔軟な膜を有する培養プレートでこの技術を組み合わせることで、長期間にわたって巡回ひずみを適用することができます。これらのプレートで培養が容易なほか、中と構造の可視化はまだ接続されていると滅菌しばらくの除去が可能になります。これは、関連リフォームプロセスリアルタイム時間経過またはさえを勉強できます。
変形および将来のアプリケーション：シ ステムの将来のアプリケーションは、インテグリンアセンブリまたはシグナル伝達を妨げるメタロまたはエージェントを追加することで、例えば、3次元モデリングプロセスを操作することで見つけることができます。細胞およびコラーゲン（再）組織を研究する際に添加剤のアプリケーションの横に、モデルシステムの構成要素を容易に変更することができる。異なる細胞源、健康と病気の細胞、コラーゲンマトリックス（培養時間を変化させることによって）の成熟、及び構築物の形状およびサイズは、特定のニーズに適合させることができる。システムはよくsです代わりに現在使用HVSCsの他の細胞源に対してuited。我々はHVSCsより巡回ひずみによって異なることECFCs向ける彼らの生産コラーゲン観察、、我々はすでに、文化内皮コロニー形成細胞（PlosOne、出版のために受け入れECFCs）にこのシステムを使用しています。
技術の限界 ：現在のモデルシステムの限界は、15×10 6細胞/ mlの細胞密度を使用した場合コンストラクト当たり1.5×10 6細胞を必要とし、組織の比較的大きいサイズである。これにより、少ない利用可能な細胞源が使用される場合に問題を引き起こすことがある。別の制限は、（厚）ベルクロ添付ファイルが原因である構造体（約1mm）を、現在の厚さである。これは、サンプル全体の一部のみに共焦点走査を制限します。これは、現在の組織のコア内の細胞応答を視覚化するのに十分であり、組織内の最大200μmの深さに達することが可能であるが、行うESは完全な厚さの概要になりません。
重要なステップとトラブルシューティング ：モデルシステムは、ベルクロ接続点との間の組織の形成に基づいているように、これは、プロトコルにおける重要なステップを包含する。正しいカットと糊付けは必須であり、特別な注意が周期的歪みを適用するために重要である組織を適切に取り付けるためのベルクロストリップにゲル混合物を注意深くピペッティングに支払われるべきである。さらに決定的な工程は、細胞源と媒体添加剤の選択において見出すことができる。時々の細胞培養源と最適化が必要となる。現在、構築物を分解からフィブリンを停止し、7日間ACAで培養される。異なる細胞源はまた、コラーゲンの形成およびフィブリン分解の両方に関して異なる時間枠内で生じ得る。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究では、生体材料（BMM）研究所の研究プログラムで実施した。 BMMは、経済情勢、農業イノベーションのオランダの省cofundedされています。 NederlandseのHartstichtingの財政的貢献は感謝して承諾されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| GlutaMax | Gibco | 35050-079 | |
| Elastomer and curing agent | Dow Corning Corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Bioflex culture plates | Flexcell Int | BF-3001U | Untreated |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphatase | Sigma | A8960 | |
| ε-Amino Caproic Acid | Sigma-Aldrich | D7754 | |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| 0.45 syringe filter | Whatmann (Schleicher and Scheul) | 10462100 | |
| Polystyrene microspheres | Invitrogen | F-8829 | Blue fluorescent, 10 μm diameter |
| Flexcell FX-4000T | Flexcell Int | Includes rectangular loading posts | |
| Cell Tracker Orange | Invitrogen Molecular Probes | C2927 | |
| CNA35-OG488 | Cordially provided by the Laboratory for Macromolecular and Organic Chemistry, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta laser scanning microscope and Two-Photon-LSM mode | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Needed for cell isolation |
References
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