Summary
Vi presenterer en ny polyakrylamid hydrogel, kalt hydroxy-PAAM, som gjør at en direkte binding av ECM proteiner med minimal kostnad eller ekspertise. Kombinasjonen av hydroxy-PAAM hydrogeler med microcontact utskrift forenkler uavhengig kontroll av mange signaler av den naturlige cellemikromiljøet for å studere cellulære mechanostransduction.
Abstract
Det er nå godt etablert at mange cellulære funksjoner er regulert av interaksjoner av celler med fysio og mekaniske signaler av deres ekstracellulære matrise (ECM) miljø. Eukaryote celler stadig forstand deres lokale mikromiljøet gjennom overflate mechanosensors å transduce fysiske endringer av ECM i biokjemiske signaler, og integrere disse signalene for å oppnå konkrete endringer i genuttrykk. Det er interessant å fysiokjemiske og mekaniske parametere for ECM kan par med hverandre for å regulere celle skjebne. Derfor er en nøkkel til å forstå mechanotransduction å kople den relative bidraget av ECM signaler om cellulære funksjoner.
Her presenterer vi en detaljert forsøksprotokoll for å raskt og enkelt generere biologisk relevante hydrogeler for den uavhengige tuning av mechanotransduction signaler in vitro. Vi kjemisk modifiserte polyakrylamidprodukter hydrogeler (PAAM) til å overvinne sine egen ikke-adhesive egenskaper ved å innlemme hydroksyl-funksjonalisert akrylamidmonomere under polymeriseringen. Vi har oppnådd en ny PAAM hydrogel, kalt hydroksy-PAAM, som tillater immobilisering av en hvilken som helst ønsket art av ECM-proteiner. Kombinasjonen av hydroksy-PAAM hydrogeler med microcontact utskrift gjør det mulig å uavhengig styre morfologien av enkelt-celler, matrisen stivhet, arten og tettheten av ECM-proteiner. Vi tilbyr en enkel og rask metode som kan settes opp i hver biologi lab for å studere in vitro celle mechanotransduction prosesser. Vi validere denne nye todimensjonal plattform ved å utføre eksperimenter på endoteliale celler som utviser en mekanisk kopling mellom ECM stivhet og kjernen.
Introduction
Mange sider ved den lokale cellulære mikromiljø (for eksempel, stivhet, porestørrelse, arten av proteiner, eller celle-tettheten ligand) gir et koordinatsett av regulatoriske signaler som styrer cellulære prosesser som motilitet, celleproliferasjon, differensiering og genekspresjon. Modifikasjoner av de fysiokjemiske egenskapene til det ekstracellulære miljø kan oppfattes av celler og forårsake forskjellige fysiologiske konsekvenser, herunder deformasjon av cellepolarisering, migrering og differensiering. Det er fortsatt uklart, men hvordan celler sette ECM modifikasjoner i cellulære biokjemiske signaler. Det er derfor av stor betydning for ingeniør kontrollert in vitro microenvironments som kan reprodusere samspillet mellom celler og deres mikromiljø for å studere mechanotransduction trasé. For å løse dette problemet, har vi nylig innført en ny metode 1, kalt hydroxy-PAAM hydrogeler, å enkelt generere to-kronensional myke matriser som tillater å selvstendig styre viktige mechanotransduction pekepinner: matrix stivhet, cellegeometri og nedkomst, natur av proteinet og celle-ligand tetthet.
ECM dirigerer cellulære prosesser via gradienter i morphogens (kjemotaksis), selvklebende proteiner (haptotaxis) og stivhet (durotaxis). I løpet av de siste tiårene, avansert in vitro plattformer har blitt utviklet for å isolere disse ekstracellulære signaler for å erte ut hvordan cellene er i stand til å oversette biokjemiske og biofysiske funksjoner i fysiologiske prosesser 2-5. Elektron-strålen 6, fotolitografi 7, fotokjemisk immobilisering 8, eller plasma-assistert 9 teknikker har blitt utviklet for å styre veksten av levende celler på micropatterned substrater. Selv om disse teknikkene har gitt viktige resultater, de fleste av dem ikke tillate diskriminering mellom den enkelte påvirkning av forskjellige signaler på celle atferdog de krever tekniske anlegg som få laboratorier kan ha råd til. Blant disse teknikkene, microcontact utskrift (μCP), har dukket opp som en robust og tilgjengelig metode for å skape celle-klebende mikro øyene 10. Flere nylig, omfattende arbeid 11-14 har blitt gjort for å utvikle μCP på hydrogeler med tunbare stivheter for å reprodusere det brede spekter av stivheter observert i levende vev. Blant disse arbeidene har polyakrylamid (PAAM) blitt populært 15 og er allerede en av de mest brukte polymerbaserte matriser for celle Biomekanikk analyser.
PAAM overflater blir ofte funksjonalisert med heterobifunksjonell tverrbinder N-sulfosuccinimidyl-6-[4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) og ECM-proteiner er knyttet til overflaten av UV-aktivering av sulfo-SANPAH nitrofenyl Azide grupper 16. En annen teknikk består i koblings hydrazin for proteiner som er sterkt oksydertmed perjodat 17. Hynd og kollegaer innført en teknikk for patterning biomimetic hydrogel overflater med protein og peptider som krever fotopolymerisasjon i nærvær av en acroyl-streptavidin monomer 18. Mer nylig, Tseng et al. Har rapportert om en ny metode micropatterning 19 basert på UV eksponering av PAAM gjennom en optisk kvarts maske som trenger å inkubere aktiverte PA geler med 1-etyl-3-[3-dimetylamino-propyl] karbodiimid-hydroklorid (EDC) og N-hydroksysuksinimid (NHS) vannoppløsninger før legge proteinet. Til tross for muligheten av disse teknikker for å skape homogene og reproduserbare proteiner micropatterns, de fleste av dem lider av store begrensninger: lang synteseprosesser (for eksempel dialyse, lyofilisering, etc), dyre kjemiske forbindelser (f.eks hyaluronsyre, sulfo-SANPAH) eller fjerne ultrafiolette bestråling. I tillegg trenger disse teknikkene ikke tillate uavhengige modulering av underlaget stivhet, micropatterngeometri, ECM-proteinnatur, og celle-ligand tetthet.
Tar disse begrensningene i betraktning, har vi utviklet en ny og enkel akrylamid basert tilnærming som gjør at immobilisering av en rekke proteiner og biomolekyler på myke hydrogel og tillater uavhengig tuning av mechanotransduction pekepinner for å dechiffrere deres rolle på cellulære funksjoner. I stedet for å behandle PAAM hydrogeler med sterke kjemiske forbindelser, innfører vi en kommersiell akrylamidmonomer med hydroksylgrupper under PAAM polymerisasjon. Denne enkle operasjonen overvinner den iboende anti-klebende eiendom PAAM hydrogel uten andre tekniske krav.
Tilstedeværelsen av hydroksylgrupper fører til en høy affinitet for hydroksy-PAAM hydrogeler for proteiner og biomolekyler som danner hydrogen-bindingsinteraksjoner. I kombinasjon med μCP, hydroxy-PAAM hydrogeler muliggjøre en rask generering av to-dimensjonale kultur plattform med en uavhengig kontrollpå matrise stivhet, type ECM proteiner, celle-ligand tetthet og begrenset klebrighet, som er tenkt å være en kraftig plattform for å studere mechanotransduction.
Hensikten med denne protokollen er å gi nødvendig informasjon for lett å lage hydroxy-PAAM hydrogeler uten kompetanse på materialvitenskap. Det ultimate målet er å gi et middel for forskere å spørre fysiologisk relevante spørsmål på cellenivå og vevsnivåer som kan føre til en bedre forståelse av mechanotransduction trasé involvert i patofysiologiske mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aktivering Overflaten Glass Dekk
- Plasser glass sirkulære Dekk (mm diameter 25) i en petriskål og smøre 0,1 M NaOH løsning på det i 5 min (avtrekkskap anbefales).
- Fjern NaOH-løsning og fordype Dekkglass med sterilt DDH 2 O i 20 min mens forsiktig vuggende på en gynge plate i et sterilt kultur hette.
- Renne steril DDH 2 O og gjenta trinn 1.2.
- Fjern Dekkglass med steril pinsett og legg dem i en ny petriskål med aktivert ansiktet opp.
- Tørre Dekk henhold en jevn strøm av høyrent nitrogengass.
- I et sterilt kultur hette, smøre et tynt lag av 3-(trimetoksysilyl) propyl-akrylat (92%) på aktivert side av dekkglass i 1 time.
- Utstrakt vaske glass Dekk med tre vasker av steril DDH 2 O og dyppe dem i sterile DDH 2 O i en ny petriskål.
- Trykk på petriskålmed Parafilm og plassere den på en rocker plate under forsiktig omrøring i 10 min.
- Fjern Dekkglass fra DDH 2 O med steril pinsett med fin tips og plassere dem i en ny petriskål med aktivert ansiktet opp.
- Oppbevar ved RT på et tørt sted med aluminiumsfolie for å unngå støv fester seg til dekkglass.
2. Fremstilling av hydroksy-PAAM Hydrogeler
- Tilbered en vekt av 65 mg N-hydroksyetyl akrylamid (HEA) i et 1,5 ml Eppendorf-rør. Det er viktig å fremstille en frisk HEA løsning.
- Tilsett 1 ml av 50 mM HEPES-buffer til HEA og blandes ved hjelp av en vortex inntil fullstendig HEA oppløsning.
- Tilsett 400 pl 40% vekt / vekt i HEPES-akrylamid-løsning og det nødvendige volum av 2% w / w i HEPES-bis-akrylamid-løsning (se tabell 1) for å oppnå den ønskede stivhet hydrogel. Juster med 50 mM HEPES til et sluttvolum på 5 ml.
- Bland løsningen ved hjelp av en vortex og Degas deti et vakuumkammer i 20 min for å redusere oksygenkonsentrasjonen i løsningen, noe som forhindrer hydroksy-PAAM polymerisasjon.
- Under en steril hette, filtrere avgasset oppløsning med en 0,2 mikrometer porestørrelse filter for å sterilisere den.
- Aktiver sirkulære glassDekk (22 mm diameter) i en UV / ozon renere under 7 min.
- Forbered 100 pl av 10% ammoniumpersulfat (APS) løsning, det vil si 10 mg APS i 100 ul DDH 2 O. Det er viktig å fremstille en frisk APS-løsning.
- Legg 2,5 mL av tetrametylendiamin (TEMED) og 25 pl av APS-løsning til den steriliserte hydroksy-PAAM oppløsning (trinn 2,5) for å initiere polymerisasjonen. Bland løsningen ved tre suksessive pipettings uten innføring av bobler, under sterile betingelser.
- Under en steril hette, plassere en 25 pl dråpe av hydroksy-PAAM løsning på en 25 mm dekkglass (tilgjengelig fra trinn 1.9) og umiddelbart plassere en 22 mm glass dekkglass (fremstilt i trinn 2.5) på toppen av dråpe å presse hydroksy-PAAM løsning. Sentrer 22 mm glass dekkglass med steril pinsett og jevne ut eventuelle bobler.
- Tillat hydroxy-PAAM hydrogeler å polymerisere ved RT i 15 min. Invert manuelt gjenværende hydroksy-PAAM løsning i Eppendorf-rør til å følge fullførelsen av polymerisasjonsprosessen.
- Helt dyppe dekkglass med sterilt DDH 2 O og forsiktig skille de 22 mm glassdekkglass ved å innføre den kant av et knivblad mellom de 22 mm glassdekkglass og hydroksy-PAAM hydrogel-laget.
- Vask hydroxy-PAAM hydrogeler med sterilt PBS (3 utveksling av PBS) og la gels fullstendig oppslukt i sterilt PBS å opprettholde hydrering.
- Oppbevar hydroxy-PAAM hydrogeler i steril PBS ved 4 ° C i opp til 3 dager.
3. Polydimethylsiloxane (PDMS) Microstamp Fabrication
MERK: Fabrikasjon av en silisium mester er nødvendig før start de PDMS microstamp fabrikasjon. Dette microfabrication av en silisium-master kan gjøres ved litografiske teknikker, som krever spesialisert utstyr og opplæring. Samarbeid med en nanofabrikasjon anlegget oppfordres til å dikte silisium mester. Alternativt, ta kontakt med et selskap som fabricates skreddersydde microstructured silisium mestere på forespørsel. Det er viktig å merke seg at ved fremstillingen av silisium hoved trenger bare å utføres en gang. Faktisk kan microstructured silisium mestere brukes på ubestemt tid å produsere elastomer frimerker.
- Bland PDMS og herdemiddel i en 10: 1-forhold i et plastbegerglass og bland godt ved hjelp av en pipette i 10 min.
- Avgasse PDMS blandingen under vakuum for å fjerne luftbobler som ble dannet under trinn 3.1.
- Plasser microstructured silisium master i en petriskål og kastet en 10-mm tykt lag av avgasset PDMS blandingen på det uten at det dannes bobler.
- La kurere PDMS for to timer ved 60 ° C i enovnen.
- I et støvfritt miljø, peel-off PDMS lag og avgifts 1 cm 2 microstamps med en skalpell.
- Bruk pinsett, microstamps sted PDMS mønster-up i en petriskål.
4. Micropatterning Hydroxy-PAAM Hydrogeler
- Plasser PDMS microstamps i en etanol / vann (50/50) løsning og sonicate i 15 min.
- Tørk de stempler med en strøm av nitrogenstrømmen og plassere dem mønster-opp i et UV / Ozone renere (λ <200 nm) i 7 min.
- Under en steril hette, plassere en 150 pl dråpe av et ønsket protein-løsning (for eksempel 100 pg / ml laminin i PBS eller 25 pg / ml fibronectin i PBS) på microstructured overflaten av en 1 cm 2 PDMS stempel.
- Valgfritt: Endre konsentrasjon i proteinoppløsningen for å modulere celle-ligand tetthet.
- Spre proteinoppløsningen på tvers av stempelflaten ved å bevege det med en steril tuppen av en pipette mot hvert hjørnestempelet.
- La proteinoppløsningen for å adsorbere på PDMS stempel i 60 minutter under en steril hette. Slå av lamper for å unngå protein skade.
- Under en steril hette, overfører hydroksy-PAAM belagte dekkglass (tilgjengelig fra trinn 2.13) inn i en petriskål.
- Fjern overskudd PBS fra overflaten av hydroksy-PAAM substrater med en svak nitrogenstrøm under sterile betingelser. Stans operasjonen så snart ingen bevis for stående vann på gelen overflaten observeres. Gelen bør ikke tørkes grundig ved dette stadiet.
- Tørr nøye strukturert overflate av PDMS stempel med en jevn strøm av høyrent nitrogengass.
- Hold i protein-belagte stempel med dressing vev tang og plassere den strukturerte overflate i kontakt med den tørkede hydrogel overflate. Påfør korte trykkpunkter med tuppen av en pinsett på toppen av PDMS stempel for å sikre en god kontakt mellom stempel og microfeatures hydrogel overflate.
- La PDMS stempel på the hydrogel overflate i 1 time ved RT.
- Forsiktig fjerne PDMS frimerker fra hydroxy-PAAM hydrogeler med dressing vev tang og følge trinn 4.1 å rengjøre stempelet.
- Vask grundig de stemplede hydroxy-PAAM hydrogeler av tre utveksling av PBS (pH = 7,4) i sterile forhold i 10 min per bytte.
- Tilleggsutstyr: Ekstra micropatterns av andre ECM proteiner kan legges til hydroxy-PAAM overflaten ved å følge trinn 04.05 til 04.11.
- Passivere ikke-trykte soner med en steril oppløsning av BSA på 5 mg / ml i PBS i løpet av en natt ved 4 ° C under forsiktig agitering på en gynge plate.
- Vask grundig etter tre utveksling av PBS (pH = 7,4) i sterile forhold i 10 min per bytte. På dette stadium, kan stemplet hydroxy-PAAM hydrogeler bli lagret ved 4 ° C opp til en uke.
5. Cell Nedfall på Micropatterned hydroxy-PAAM Hydrogeler
- Inkuber Dekk i celle media for 30-45 min før plating calen.
- Vask adherente celler dyrket i en 75 cm to kulturkolbe med steril PBS ved 37 ° C, og denne fjernes med 3 ml trypsin-EDTA eller accutase for 10 min.
- Overfør den ønskede mengde forvarmet komplett vekstmedium egnet for cellelinje inn i kolben inneholdende de løsnede celler og sentrifuger cellesuspensjonen i 3 min ved 650 x g i.
- Fjern supernatanten med en mikropipette og resuspender cellene i komplett kulturmedium på 15-20,000 celler / ml.
- Tilsett 4 ml av celleløsningen til en micropatterned dekkglass (fremstilt i trinn 5.1) og plassere cellen dekket av dekkglass i et kulturinkubator ved 37 ° C og 5% luftfuktighet i 1-2 timer.
- Sug forsiktig fristilt celler og erstatte kultur medium. Retur de festede celler til inkubatoren og la dem spres fullstendig (3-6 timer, avhengig av celletypen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser den ko-polymerisering av akrylamid (AAM) og bisakrylamid (BIS-AAM) med N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monomerer inneholdende en primær hydroksylgruppe dannet ved tilfeldig radikal polymerisasjon en hydrofil nettverk av polyakrylamid med innlagte hydroksylgrupper (hydroksy-PAAM) . I denne protokollen, må en vekt 65 mg av HEA bli fortynnet i et volum på 1 ml av HEPES. Å vite at tettheten av HEA er omtrent lik en, antar vi at vi får en arbeidsvolum på 1065 mikroliter (HEA + HEPES). Som presentert i tabell 1, er den totale tilsetning av 1,065 mL til 400 pl av AAM og 50 pl av bisAAm fører til et volum på 1515 pl. Derfor et volum på 3485 pl av HEPES er nødvendig for å justere løsningen til et sluttvolum på 5 ml. Som indikert i trinn 2.6, må overflaten av 22 mm glass dekkglass aktiveres under 7 min i en UV / Ozone for å fjerne det uten å forårsakeEventuelle skader på hydrogel overflaten. Faktisk blir glassflaten mer hydrofil etter UV / Ozone behandling, og kan derfor lett fjernes ved å dyppe hele systemet i vann. I tillegg er den UV / Ozone behandling forhindrer kjemisk forurensning av 22 mm dekkglass, som er i direkte kontakt med hydrogelen overflate. Denne teknikk tillater å oppnå en flat sirkulær polyakrylamid overflate (22 mm i diameter) bundet til et glass dekkglass (25 mm i diameter).
Som vist i figur 1B, kan micropatterns fra proteiner lages på overflaten av hydroksy-PAAM hydrogeler ved microcontact trykking. I denne eksperimentelle prosedyre, UV / Ozone eksponeringer tillate midlertidig å redusere den iboende hydrofobisitet av PDMS stempler ved å danne silanolgruppene på overflaten. Faktisk frembringer 185 nm linjen ozon fra molekylært oksygen mens 254 nm linjen omdanner ozon til atomært oksygen. Denne reaktive arter angriper siloksan backbone av PDMS å danne oksygenrike SIOX silika-lignende lag og Si-OH overflategrupper. Den oksyderte PDMS overflaten er kjent for å gjenopprette dets hydrofobisitet i løpet av timer etter eksponering for luft på grunn av migrering av lavmolekylære uformettede polymerkjeder fra bulkfasen til overflaten. Denne strategien bidrar til spredning av proteinoppløsningen på overflaten av PDMS stempel.
En av de viktigste fordelene ved denne metode er å modulere uavhengig matrise stivhet (figur 2A), micropattern geometri (figur 2B), celle-ligand tetthet (Figur 2C), og proteinnatur (Figurene 3A og 3B). Som vist i figur 2A, hydroxy-PAAM hydrogeler viser en lineær avhengighet av elastisitetsmodul på tverrbindingskonsentrasjon fra noen få kPa til flere titalls kPa, noe som gir god reproduksjon av stivheten av det cellulære mikromiljø. Figur 2B Figur 2C viser at cellen -ligand tetthet kan moduleres ved å variere konsentrasjonen av det proteinløsningen som brukes til å inkubere PDMS stempler. Figur 3 viser et fluorescens-bilde av kollagen linjer stemplet på tvers av laminin og fibronektin linjer ved hjelp av sekvensielle microcontact opptrykk.
Det er interessant for leserne å merke seg at ulike størrelser og former av micropatterns har blitt stemplet effektivt, uavhengig hydrogel stivhet. Vi har gjengitt med hell microfeatures av proteiner med skarpe kanter (f.eks trekanter og stjerner) og rett (f.eks linjer), eller buet (f.eks sirkler) figurer, som viser at det ikke er major begrensning til mønsteret kompleksitet. For enkeltcelle eksperiment, den micropattern overflateareal på mellom 400 og 2500 mikrometer 2, den nedre verdi som svarer til det ytterste av enkeltcellelevedyktighet. Som mange andre microprinting-baserte metoder, den viktigste begrensningen av det presenterte metoden gjelder sin romlig oppløsning. På stive hydrogeler (E> 10 kPa), er den romlige oppløsningen rundt mikrometer og hovedsakelig bestemt av oppløsningen til stempelet, mens den "myke" hydrogeler, blir grensen for oppløsningen bestemmes delvis av overflate deformasjon som kan oppstå i løpet av proteinoverføring.
Giftigheten av hydroksy-PAAM hydrogeler ble undersøkt ved å kvantifisere levedyktigheten av primære endotelceller belagt for 1, 2, og 3 dager i kultur på homogent belagt og microprinted myke hydroksy-PAAM hydrogeler (Figur 4A). Omtrent 80% av HUVECs belagt på micropatterned myke hydroxy-PAAM hydrogeler vedlikeholdtderes levedyktighet i tre døgn, noe som demonstrerer den biokompatibilitet av hydroksy-PAAM hydrogeler for celledyrking. Interessant nok var lik levedyktighet oppnådd i vårt laboratorium med primære kortikale nevroner celler. I tillegg er de primære endotelceller spre seg mer på "stiv" (500 kPa) i forhold til "myke" (25 kPa) substrater (figur 4B), som indikerer at denne metoden gir en passende mikromiljø for å studere cellulær proliferasjon over et bredt spekter av stivheter .
Å kople effekten av underlaget stivhet og spre område på mechanotransduction ble primære endotelceller (HUVECs) belagt på rektangulære FN-belagt micropatterns (konstant areal på 1200 mikrometer 2) avsatt på hydroxy-PAAM hydrogeler av tre forskjellige stiffnesses (2.5, 8.5, og 25 kPa). Deretter ble HUVECs farget for aktin filamenter, vinculin og DNA ved å følge en standard prosedyre immunocytokjemi, som brukes for mammaLian celler belagt på glass underlag. På de mykeste underlag, HUVECs utviser lav aktin fiber tetthet og en avrundet kjernen, mens på stivere underlag, aktin fibrene er rettere og tykkere og kjernen deformert (figur 5). Endringer i substratet stivhet ved konstant spre området modulere spenningen og distribusjon av aktin spennings fibre, noe som resulterer i remodellering av kjernen. Denne observasjonen antyder en mekanisk kobling mellom matrise stivhet, cytoskjelett, og kjernen.
| Slutt Aam / bisAAm ratio | AAM 40% (ul) | Vekt av HEA å oppløse i 1 ml HEPES (mg) | bis Aam (2%) (Il) | HEPES (il) | Youngs modulus (10 3 Pa) |
| 0,2 / 50 0,5 / 50 1/50 2/50 3/50 | 400 400 400 400 400 | 65 65 65 65 65 | 50 125 250 500 750 | 3485 3410 3285 3035 2.785 | ~ 1.4 ~ 3.6 ~ 8.7 ~ 17.2 ~ 25 |
Tabell 1. Tilberedning av hydroxy-PAAM hydrogeler med ulike stivheter. Arbeidsløsninger for å forberede hydroxy-PAAM hydrogeler med endelig stivhet spenner 1,4 til 25 kPa.
Figur 1 (A) Akrylamid (AAM, i sort), N, N'-metylenbisakrylamid (bis-Aam, i blått) og N-hydroxyethylacrylamide (HEA, rødt) ble blandet sammen for å danne hydroksy PAAM hydrogeler. (B) Skjematisk fremstilling av de ulike trinnene i micropatterning prosedyren på hydroxy-PAAM hydrogeler. En oppløsning av protein blir først inkubert i 1 time på strukturen ansiktet til en microstamp (trinn 1). Den hydrogel overflate er forsiktig tørket med en nitrogenstrøm (trinn # 2). Den microstamp blir deretter plassert i kontakt med den formelle hydroksy-PAAM overflaten under 1 time (trinn 3). Etter suksessive vaskinger, er microprinted overflaten passiveres med en steril løsning BSA deponert O / N ved 4 ° C (trinn # 5) for å blokkere ikke-trykte områdene. Endelig er microprinted hydroxy-PAAM overflaten vasket flere ganger med sterilt PBS og er klar for celle seeding (trinn 6). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1010 / 51010fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2 (A) Utviklingen av stivheten av hydroxy-PAAM hydrogeler er lineært korrelert med mengden av bis-AAM tverrbinder (den røde linje er en lineær regresjon med R2 = 0,995). (B) Fluorescens bilder rektangulær laminin mikro funksjoner stemplet på hydroksy-PAAM hydrogeler med forskjellige stivheter (E = 2,5, 15, og 40 kPa). Skala barer tilsvarer (A) 65 mikrometer, (B) 80 um, og (C) 50 mikrometer. (C) parallelle rekker 15 mikrometer bredde danner en LM gradient på 25 kPa hydroksy-PAAM hydrogel, som indikert ved utviklingen av fluorescens intensitet profil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
n "src =" / filer / Ftp_upload / 51010 / 51010fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. (A) Immunfluorescens bilde av Fibronectin (i rødt) og Laminin (i grønt) striper krysset ved 90 °. (B) Multilabeling av Fibronectin (i rødt), Laminin (i grønt) og kollagen (i blått) striper microprinted senere på en 25 kPa hydrogel PAAM underlaget. Scale barer tilsvarer 30 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. (A) kvantifisering av cellelevedyktighet oppviste utmerket celleoverlevelse ved 24, 48 og 72 timer etter å ha blitt belagt på homogent-belagt og micropatterned hydroksy-PAAM overflater. Det oppgitte nummeret påbunnen av hver linje svarer til det totale antall celler telles for levedyktigheten analysen. (B) Kvantifisering av HUVECs spredning på 25 og 500 kPa homogent-belagte substrater etter 1 (hvite streker) og 7 (hashed søyler) dagers dyrking. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Fluorescent bilder av immunfargete primære endotelceller dyrket på rektangulære FN-belagt micropatterns, som ble avsatt på hydroxy-PAAM hydrogeler på 2,5 kPa, 8,5 kPa, og 25 kPa (fra venstre til høyre). Aktin stresset fibre (i grønt ) ble farget med Alexa Fluor 488 phalloidin, fokale sammenvoksninger (i rødt) ble farget med en mus polycloNAL primære antistoff og merket med en rød-fluorescerende IgG sekundært antistoff og DNA var farget i blått med DAPI. Skalaen barer tilsvarer 17 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange in vitro observasjoner i moderne cellebiologi er utført på stive glassDekk, ofte belagt med et tynt lag av ECM proteiner eller syntetiske peptider som inneholder RGD-sekvensen. Men ikke slike grunnleggende kultur underlag ikke rekapitulere hele fysisk-kjemiske kompleksiteten i ECM og dermed ikke gi en nøyaktig modell for å studere cellulære mechanotransduction prosesser. For å takle dette problemet, foreslår vi en enkel alternativ til functionalize todimensjonale hydrogeler med ønsket beløp og natur ECM proteiner. Denne metoden tillater uavhengig styring av viktige mechanotransduction signaler, slik som matrise stivhet, cellulær morfologi og innesperring eller celle-ligand tetthet. I tillegg, hydroksy-PAAM hydrogeler vunnet en av de største begrensninger i eksisterende funksjonalise metoder, som er den manglende evne til å immobilisere og til å styre den romlige fordeling av mer enn ett ECM-proteiner. På grunn av høy affinitet av hydroxy-PAAM hydrogeler for biomolekyler, kan man kontrollere om den romlige fordeling av ulike ECM-proteiner på den samme overflaten, uavhengig matrisen stivhet, ved å bruke sekvensiell microprintings, som ikke krever noe tilleggsutstyr.
Vi foreslår en roman prosedyre basert på inkorporering av hydroksylgrupper innen akrylamid hydrogeler å overvinne sine iboende ikke-selvklebende egenskaper med minimale krav i kostnader eller kompetanse. I sammenligning med eksisterende teknikker for patterning proteiner på hydrogeler, unngår hydroksy-PAAM metoden bruk av sterke toksiske kjemikalier (for eksempel hydrazinhydrat), dyre fotoreaktive tverrbindingsmidler (f.eks, sulfo-Sanpah) og avhengigheten av UV-lampen strøm og posisjonering til functionalize myke hydrogeler. Hydroxy-PAAM hydrogeler være stabil og aktiv i flere uker, kan bli masseprodusert, lett microprinted og deres høye affinitet for biomolekyler gjør det mulig å undersøke effektene av synergiskonjugerte ECM proteiner på cellefunksjoner. I tillegg, kan hydroksy-PAAM hydrogeler kan brukes til å kvantitativt undersøke mengden av kontraktile krefter som utøves av celler på deres omkringliggende mikromiljøet. Faktisk har vi vist tidligere 1,20 at fluoriserende perler kan enkelt integreres i hydroxy-PAAM hydrogeler, for å kunne bruke mobil trekkraft mikroskopi (TFM) for å måle forskyvningsfeltet og anslå den resulterende trekkraft feltet utøves av eukaryote celler belagt på todimensjonale micropatterns.
Som mange andre microprinting-baserte metoder, den viktigste begrensning av hydroxy-PAAM hydrogeler gjelder romlig oppløsning av protein microfeatures. På stive hydrogeler (E> 10 kPa), er den romlige oppløsningen rundt en mikrometer, og hovedsaklig bestemt av oppløsningen til stempelet, avhengig av litografiteknikk som brukes til å fremstille silisium støpeformen. På mykere hydrogeler, blir romlig oppløsning bestemmes delvis av the overflate deformasjon under proteinoverføring, som blir den hovedsakelige begrensning for å nå mikrometer romlig oppløsning. Tilnærmingen som presenteres her er foreløpig begrenset til to-dimensjonale underlag. Men denne metoden er svært skalerbar og videre studier er for tiden i gang i vårt laboratorium for å utvide denne metoden til tre-dimensjonale strukturer.
Vi håper at hydroxy-PAAM hydrogeler kan bidra til å dechiffrere viktige mekanismer for komplekse cellulære og vev prosesser som er nært knyttet til de fysiske og kjemiske egenskaper i cellen mikromiljøet 21,22, inkludert embryoutvikling, inflammatoriske responser, sårheling, neurite utvekst, voksen vev homeostase, og patogenesen av sykdommer så som fibrose og kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0.2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin (rabbit) | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
References
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
- Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).
- Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
- Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
- Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
- Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
- Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
- Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
- Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
- Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499 (2012).
- Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).
- Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
- Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671 (2012).
- Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
- Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).
