Un método mejorado para la preparación de colágeno tipo I De Piel

Resumen

Los procedimientos tradicionales para el aislamiento de tipo soluble 1 colágeno (COL1) requieren unos 10 días a partir de principio a fin, a causa de largas incubaciones de amortiguación y resuspensiones laboriosas de fibrillas. A continuación, describimos un medio para purificar COL1 de pequeñas biopsias dérmicas en menos de 3 horas.

Resumen

Tipo soluble 1 de colágeno (COL1) se utiliza ampliamente como un sustrato adhesivo para cultivos de células y como un andamiaje celular para aplicaciones regenerativas. Clínicamente, esta proteína es ampliamente utilizado para la cirugía estética, inyecciones dérmicas, injerto de hueso, y la cirugía reconstructiva. Las fuentes de COL1 para estos procedimientos son comúnmente no humano, lo que aumenta el potencial para la inflamación y el rechazo, así como la transmisión de enfermedades de xenobióticos. En vista de esto, un método para purificar de manera eficiente y rápidamente COL1 a partir de cantidades limitadas de tejidos derivados autóloga-sería eludir muchos de estos problemas, sin embargo, los protocolos estándar de aislamiento son largos y requieren a menudo grandes cantidades de tejidos de colágeno. Aquí, se demuestra un método de extracción COL1 eficiente que reduce el tiempo necesario para aislar y purificar esta proteína de aproximadamente 10 días a menos de 3 horas. Elegimos la dermis como nuestra fuente de tejido debido a su disponibilidad durante muchos procedimientos quirúrgicos. Tsu método utiliza buffers de extracción tradicionales combinados con agitación enérgica y filtración centrífuga para obtener alta pureza, COL1 soluble de pequeñas cantidades de corion. En pocas palabras, las biopsias dérmicas se lavan a fondo en DH helada ₂ O después de la eliminación de grasa, tejido conectivo, y el cabello. Las muestras de piel se eliminan de las proteínas y los polisacáridos no colágenas utilizando 0,5 M de acetato de sodio y un homogenizador de alta velocidad de sobremesa. El colágeno de sólidos residuales se extrae posteriormente con un tampón de citrato de sodio 0,075 M usando el homogeneizador. Estos extractos se purificaron usando 100.000 MW de corte filtros centrífugos que producen preparaciones COL1 de calidad comparable o superior a los productos comerciales o los obtenidos utilizando procedimientos tradicionales. Anticipamos este método facilitará la utilización de derivados de forma autóloga-COL1 para una multitud de aplicaciones de investigación y clínicos.

Introducción

Durante décadas, los investigadores y los proveedores comerciales han aislado solubilizado COL1 de una variedad de fuentes de tejidos incluyendo la piel y tendón utilizando alguna variación de un protocolo de extracción de ácido sencillo seguido de neutralización, lo que resulta en una resuspensión de una matriz de fibrillas COL1 organizadas que se puede utilizar para una multitud de aplicaciones biomédicas ^1-4. Si bien hay muchos ejemplos de aplicaciones clínicas para COL1, algunas de ellas emplean COL1 derivada autóloga, porque la preparación de esta proteína requiere largas extracciones de tomar días o semanas para llevar a cabo ^5-7. Como resultado, los investigadores de investigación y médicos generalmente usan preparaciones comerciales caros, de COL1 que se preparan utilizando tejidos no humanos, tales como la rata, bovino, porcino o corion o usando eliminado a partir de cadáveres de la piel o después de la circuncisión masculina. Para aplicaciones regenerativas, muchos de estos productos exhiben variabilidad con respecto a su capacidad para formar sólidamatrices o construcciones de tejido capaces de apoyar la unión de células y el crecimiento. En consecuencia, existe una clara necesidad de un nuevo método estandarizado diseñado para extraer rápidamente COL1 partir de fuentes de tejido autólogo accesibles y abundantes.

Tal método podría ahorrar tiempo y dinero en el marco de la investigación donde COL1 podría extraerse del modelo animal de interés y se utiliza para los ensayos preclínicos de la ingeniería de tejidos montados en andamios a base de colágeno. Al mismo tiempo, tener la opción de utilizar un-aislado rápidamente, COL1 derivada autóloga-en la clínica aumentaría la seguridad general para los pacientes que de otro modo recibir alogénicas o xenogénicas preparaciones. Para los pacientes que reciben una preparación autógeno, este método simplificado reduciría enormemente el intervalo entre la toma de biopsias y la aplicación de colágeno. Por estas razones, hemos tratado de mejorar en un aislamiento y purificación método COL1 de larga data con ag de alta velocidadbilitación y la centrifugación de exclusión por tamaño. Este método es fácil de realizar utilizando tampones estándar y los equipos que se encuentran en muchos laboratorios. Mediante el empleo de la agitación de alta velocidad, nuestro protocolo reduce el tiempo necesario para aislar solubles, dérmica COL1 de aproximadamente 10 días a menos de 3 horas ^8. Es importante destacar que este método se puede realizar fácilmente en el entorno clínico a fin de preparar COL1 derivada autóloga para su uso en pacientes durante un único conjunto de procedimientos.

Protocolo

Aquí vamos a demostrar el aislamiento de COL1 de la piel de cordero. Como está escrito, este protocolo también se puede utilizar para aislar con éxito COL1 de conejo y de la piel humana.

1. Preparar la muestra dérmica

1. Que todos los reactivos a 4 ° C antes de su uso.
2. Enjuagar la muestra dérmica (25-50 g) en DH helada ₂ O y eliminar cualquier lana, piel o cabello con crema depilatoria.
3. Utilice una hoja de afeitar de un solo filo para raspar la limpieza de la muestra de tejido conectivo y grasa.
4. Enjuagar la muestra en helada dH ₂ O.
5. Cortar la muestra de piel en 1 cm x 1 cm pedazos con una cuchilla de afeitar de un solo filo.

2. Retire colagenosas solubilizado material

1. Pesar 5 g de tubo cónico de la muestra por 50 ml y añadir 30 ml de acetato de sodio helado 0,5 M.
2. Mezclar los tubos durante 1 min a la configuración de 6 m / seg usando un adaptador de tubo de 50 ml en el homogeneizador de sobremesa.
3. Deseche supernatant y repita para un total de 7 ciclos de lavado de sodio acetato.
4. Enjuagar la muestra en dH helada ₂ O y mezclar una vez para eliminar el acetato de sodio residual.
5. Utilice una espátula para comprimir la muestra contra el lado del tubo para eliminar el exceso de líquido y luego se transfieren a un tubo cónico de 50 ml fresco.

3. Colágeno tipo I Extracción

1. Lavar la muestra dos veces en 2 ml / g 0,075 M de tampón de citrato de sodio durante 1 min a 6 m / seg en el homogeneizador de sobremesa compresión de la muestra y de desechar el sobrenadante después de cada lavado.
2. Añadir un nuevo 2 ml / g de parte alícuota de tampón de citrato de sodio 0,075 M a la muestra.
3. Realizar 6 secuencial 1 min, 6 m / seg ciclos de sobremesa mezcla homogeneizador de agitación sin quitar el tapón entre cada ciclo.
4. Transferir el grueso, claro sobrenadante a un tubo de colección.
5. Añadir un tampón citrato adicional de 1 ml / g de sodio 0,075 M a la muestra y realizar un homogeneizador última agitación de sobremesaciclo ción.
6. Añadir este último sobrenadante a un tubo de recogida.
7. Centrifugar el tubo de recogida a 3200 xg durante 10 min a 4 ° C.
8. Transferir el sobrenadante a el compartimiento de la parte superior de un peso molecular 100.000 cortar dispositivo de filtro centrífugo.
9. Se centrifuga a 3.200 g durante 30 min a 4 ° C.
10. Transferir el purificada COL1 del compartimiento superior a un tubo cónico limpia y se almacenan a 4 ° C.

Resultados

Este protocolo de aislamiento COL1 requiere alrededor de 2 horas y 15 minutos en completarse. La figura 1 muestra un diagrama esquemático delineando los principales pasos de este procedimiento. Preparación de la muestra y la realización de los 7 ciclos de agitaciones de alta velocidad y se enjuaga con acetato de sodio tarda aproximadamente 35 minutos (las figuras 1A-C). Realización de una agitación y enjuague ciclo con dH ₂ O toma aproximadamente 5 minutos (figuras 1D y

Discusión

Un componente crucial de este método es la compresión eficiente repetida de la muestra dérmica para eliminar el exceso de líquido. Es crítico para eliminar el acetato de sodio tanto como sea posible en el paso 2.5 mediante la compresión de la muestra. Utilizamos una espátula para compactar la piel contra el lado del tubo, sin embargo, estopilla también podría ser utilizado, aunque esto requeriría la eliminación de la muestra desde el tubo y aumentar el tiempo necesario para llevar a cabo estos pasos. Asimismo, es import...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		FastPrep-24 System	MP Biomedicals
	Beckman	J6-MI Rotor de	cangilón oscilante para alojar tubos cónicos de 50 ml a 3.200 x g.

Centrífuga 116004500