Un método mejorado para la preparación de colágeno tipo I De Piel

Resumen

Los procedimientos tradicionales para el aislamiento de tipo soluble 1 colágeno (COL1) requieren unos 10 días a partir de principio a fin, a causa de largas incubaciones de amortiguación y resuspensiones laboriosas de fibrillas. A continuación, describimos un medio para purificar COL1 de pequeñas biopsias dérmicas en menos de 3 horas.

Resumen

Tipo soluble 1 de colágeno (COL1) se utiliza ampliamente como un sustrato adhesivo para cultivos de células y como un andamiaje celular para aplicaciones regenerativas. Clínicamente, esta proteína es ampliamente utilizado para la cirugía estética, inyecciones dérmicas, injerto de hueso, y la cirugía reconstructiva. Las fuentes de COL1 para estos procedimientos son comúnmente no humano, lo que aumenta el potencial para la inflamación y el rechazo, así como la transmisión de enfermedades de xenobióticos. En vista de esto, un método para purificar de manera eficiente y rápidamente COL1 a partir de cantidades limitadas de tejidos derivados autóloga-sería eludir muchos de estos problemas, sin embargo, los protocolos estándar de aislamiento son largos y requieren a menudo grandes cantidades de tejidos de colágeno. Aquí, se demuestra un método de extracción COL1 eficiente que reduce el tiempo necesario para aislar y purificar esta proteína de aproximadamente 10 días a menos de 3 horas. Elegimos la dermis como nuestra fuente de tejido debido a su disponibilidad durante muchos procedimientos quirúrgicos. Tsu método utiliza buffers de extracción tradicionales combinados con agitación enérgica y filtración centrífuga para obtener alta pureza, COL1 soluble de pequeñas cantidades de corion. En pocas palabras, las biopsias dérmicas se lavan a fondo en DH helada ₂ O después de la eliminación de grasa, tejido conectivo, y el cabello. Las muestras de piel se eliminan de las proteínas y los polisacáridos no colágenas utilizando 0,5 M de acetato de sodio y un homogenizador de alta velocidad de sobremesa. El colágeno de sólidos residuales se extrae posteriormente con un tampón de citrato de sodio 0,075 M usando el homogeneizador. Estos extractos se purificaron usando 100.000 MW de corte filtros centrífugos que producen preparaciones COL1 de calidad comparable o superior a los productos comerciales o los obtenidos utilizando procedimientos tradicionales. Anticipamos este método facilitará la utilización de derivados de forma autóloga-COL1 para una multitud de aplicaciones de investigación y clínicos.

Introducción

Durante décadas, los investigadores y los proveedores comerciales han aislado solubilizado COL1 de una variedad de fuentes de tejidos incluyendo la piel y tendón utilizando alguna variación de un protocolo de extracción de ácido sencillo seguido de neutralización, lo que resulta en una resuspensión de una matriz de fibrillas COL1 organizadas que se puede utilizar para una multitud de aplicaciones biomédicas ^1-4. Si bien hay muchos ejemplos de aplicaciones clínicas para COL1, algunas de ellas emplean COL1 derivada autóloga, porque la preparación de esta proteína requiere largas extracciones de tomar días o semanas para llevar a cabo ^5-7. Como res....

Protocolo

Aquí vamos a demostrar el aislamiento de COL1 de la piel de cordero. Como está escrito, este protocolo también se puede utilizar para aislar con éxito COL1 de conejo y de la piel humana.

1. Preparar la muestra dérmica

1. Que todos los reactivos a 4 ° C antes de su uso.
2. Enjuagar la muestra dérmica (25-50 g) en DH helada ₂ O y eliminar cualquier lana, piel o cabello con crema depilatoria.
3. Utilice una hoja de afeitar de un solo filo para raspar la limpieza de la muestra de tejido conectivo y grasa.
4. Enjuagar la muestra en helada dH ₂ O.
5. Cortar la muestra de piel en 1 cm x 1....

Resultados

Este protocolo de aislamiento COL1 requiere alrededor de 2 horas y 15 minutos en completarse. La figura 1 muestra un diagrama esquemático delineando los principales pasos de este procedimiento. Preparación de la muestra y la realización de los 7 ciclos de agitaciones de alta velocidad y se enjuaga con acetato de sodio tarda aproximadamente 35 minutos (las figuras 1A-C). Realización de una agitación y enjuague ciclo con dH ₂ O toma aproximadamente 5 minutos (figuras 1D y

Discusión

Un componente crucial de este método es la compresión eficiente repetida de la muestra dérmica para eliminar el exceso de líquido. Es crítico para eliminar el acetato de sodio tanto como sea posible en el paso 2.5 mediante la compresión de la muestra. Utilizamos una espátula para compactar la piel contra el lado del tubo, sin embargo, estopilla también podría ser utilizado, aunque esto requeriría la eliminación de la muestra desde el tubo y aumentar el tiempo necesario para llevar a cabo estos pasos. Asimismo, es import.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		FastPrep-24 System	MP Biomedicals
	Beckman	J6-MI Rotor de	cangilón oscilante para alojar tubos cónicos de 50 ml a 3.200 x g.

Centrífuga 116004500