Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Resumen

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Resumen

Trabajar con tejido delicado puede ser un factor complicado cuando se realiza una evaluación inmunohistoquímica. Aquí, presentamos un método que utiliza una membrana de PTFE hidrofilizada soportada por anillo para proporcionar soporte estructural tanto al tejido vivo como al fijo durante el procesamiento inmunohistoquímico, lo que permite el uso de una variedad de protocolos que de otro modo causarían daño al tejido. En primer lugar, esto se demuestra con la carga en bolo de marcadores fluorescentes en el tejido vivo de la retina. Este método permite una visualización rápida de las estructuras objetivo, mientras que el soporte de la membrana mantiene la integridad del tejido durante la inyección y permite una fácil transferencia de la preparación para su posterior obtención de imágenes o procesamiento.

En segundo lugar, se describe un procedimiento para la tinción de anticuerpos en tejido fijado con carbodiimida. Aunque la fijación de paraformaldehído es más común, la fijación de carbodiimida proporciona un sustrato superior para la visualización de proteínas sinápticas. Una limitación de la carbodiimida es que el tejido fijo resultante es relativamente frágil; Sin embargo, esto se supera con el uso de la membrana de soporte. El tejido de la retina se utiliza para demostrar estas técnicas, pero se pueden aplicar a cualquier tejido frágil.

Introducción

Realizar inmunohistoquímica en tejidos delicados e intactos corre el riesgo de sufrir daños durante la manipulación y la transferencia. Esto puede ocurrir en cortes de cerebro u otro tejido delgado, como la retina degenerada. Además, existen ciertos métodos de fijación de tejidos que pueden ser ventajosos para la inmunotinción de estructuras neuronales, pero que resultan en una estabilidad estructural comprometida, lo que impide su uso. Un ejemplo particular de esto es la fijación basada en carbodiimida, que es superior para teñir los receptores y las hormonas^1-7, pero comúnmente se evita debido a la inestabilidad del tejido fijado.

Aquí, describimos un procedimiento que utiliza una membrana de PTFE hidrofilizada para soportar estructuralmente tejido delicado, ya sea fijo o no fijado, para una variedad de técnicas de tinción. La membrana de soporte permite la manipulación de tejido delicado antes y después de la fijación, lo que permite varios pasos de procesamiento y minimiza el riesgo de daño tisular. En general, este método simple para preservar la integridad de los tejidos brinda la oportunidad de utilizar técnicas que de otro modo podrían evitarse. Como tal, este enfoque también podría usarse con éxito para la preparación de una amplia variedad de tejidos, como cortes de cerebro, que se vuelven frágiles después de los procedimientos de corte.

Protocolo

En todos los procedimientos experimentales, los animales fueron tratados de acuerdo con las regulaciones de la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión y en cumplimiento con los protocolos aprobados por Weill Cornell Medical College. Los animales fueron sacrificados por dióxido de carbono y posterior luxación cervical.

1. Disección de retina entera

1. Después de la eutanasia del ratón, se le enuclean los ojos y se colocan en una solución de Ringer oxigenada con tamponamiento con HEPES (Tabla 1).
2. Retire la córnea cortando en un camino circular a lo largo de la ora serrata con tijeras pequeñas, sujetando el ojo en el limbo con pinzas. Extraiga la lente con pinzas.
3. Retire la mayor cantidad posible de vítreo con pinzas de borde romo. Este paso es importante para las inyecciones en bolo y los registros electrofisiológicos; No es necesario para cuando se realiza inmunohistoquímica sola.
4. Separe la retina del ocular colocando pinzas entre la retina y el ocular, moviendo las pinzas lentamente alrededor de la circunferencia. Estabilice la copa ocular sujetando firmemente la esclerótica con un segundo juego de pinzas. Corta el nervio óptico en la ubicación entre la retina y el ocular para facilitar la separación de la retina del ocular.
5. La retina se puede diseccionar en pedazos (por ejemplo, cuartos) o usarse como un todo. Para cortar en pedazos, use unas tijeras para hacer incisiones desde la periferia de la retina hasta el nervio óptico. Alternativamente, para usar toda la retina, haga incisiones desde la periferia hasta la mitad del nervio óptico. Las incisiones ayudarán a hacer una preparación plana.

2. Montaje en inserto de membrana de PTFE hidrofilizado

1. Prepare la membrana como se describe a continuación. Cuando se realicen registros fisiológicos o experimentos de inyección de tinte, acorte el soporte utilizando un torno o una sierra de mano para que el anillo restante tenga una altura de 1 mm.
   Nota: Los insertos de la placa de cultivo pueden estar modificados o sin modificar (Figura 1A). La elección de la configuración está dictada por el propósito del experimento. Para la inmunotinción, es adecuado un inserto no modificado.
2. Pule las superficies rugosas con papel de lija fino (grano 300 o superior).
3. (Opcional) Retire los pies debajo del anillo con unas tijeras.
4. Para eliminar cualquier residuo, enjuague o sonique la membrana en agua destilada durante 2-3 minutos.
5. Monte el tejido en la membrana (Figura 1A). Coloque el tejido con un poco de solución encima de la membrana con una pipeta de transferencia de plástico. Corte la punta estrecha de la pipeta si es necesario, para evitar que la muestra de tejido se adhiera a la pipeta durante la transferencia.
6. Unir la retina con células ganglionares (GC) hacia arriba: en la membrana, retire gradualmente la solución mientras extiende la retina y despliega los pliegues con fórceps.
7. En el lado opuesto de la membrana, coloque una jeringa vacía (1 ml) directamente debajo del tejido. Aplique la succión tirando hacia atrás del émbolo hasta un volumen de 0,2-0,3 ml. Aumente el área de superficie de succión cortando la punta de sujeción de la jeringa antes de usarla. El tejido no requiere tratamiento adicional para la adhesión, ya que está físicamente enredado dentro de la membrana.

3. Inyección en bolo de isolectina Alexa 488

1. Prepare las pipetas de parche y la solución de tinción. Extraiga pipetas de parche de vidrio capilar de borosilicato con un extractor Flaming/Brown, con una resistencia de ~1 MΩ. Rompa suavemente la punta de la pipeta.
2. Prepare la solución de tinción añadiendo 0,3 μl de solución madre de isolectina Alexa 488 a 10 μl de la solución de Ringer tamponada con HEPES descrita en el paso 1.2.
3. Transfiera la muestra a la configuración de pinza de parche para la inyección (Figura 1C). Coloque la membrana con el tejido adherido en la cámara de registro perfundida con solución de Ringer tamponada con HEPES calentada (37 °C) y oxigenada.
4. Coloque la pipeta que contiene el colorante contra la membrana limitante interna (ILM, Figura 2A). Con un micromanipulador, avance aún más la pipeta contra el ILM hasta que penetre en él. Inyecte la solución de tinción con una presión de 10-20 psi durante 1 segundo con un picospritzer. Se puede apuntar a una o varias ubicaciones para la inyección (Figura 2B). Si no se dispone de un picospritzer, se puede utilizar una jeringa de 10 ml para suministrar una presión de aire positiva para la inyección.
5. Incubar el tejido inyectado durante 10 min. Durante la incubación, el tejido inyectado se puede ver bajo iluminación de epifluorescencia.
6. Después del etiquetado, la preparación se puede llevar a un microscopio para obtener imágenes. Transfiera el inserto a una placa de cultivo con fondo de vidrio, colocando la retina con el lado hacia abajo (Figura 1C).
7. Agregue una gota de solución HEPES para mantener la muestra húmeda.
8. Coloque 2-3 puntos de grasa para aspiradora alrededor del perímetro del anillo de plástico para asegurar firmemente el inserto al fondo de la placa de cultivo.
9. Transfiera el plato a la etapa del microscopio.

4. Fijación de paraformaldehído y carbodiimida

1. Fije la muestra transfiriendo el inserto al fijador durante 15 min. Se pueden utilizar tiempos de fijación más largos o más cortos, dependiendo de la aplicación. Ambos fijadores se pueden utilizar eficazmente para fijar GFP, isolectina o hidrazidas fluorescentes de Alexa (por ejemplo, se utilizan para rellenar las células en los registros de patch-clamp)
   Nota: Para la fijación, se pueden utilizar soluciones de carbodiimida al 4% o paraformaldehído al 4%. Para mantener la adherencia, la fijación debe realizarse después de que el tejido ya se haya unido a la membrana. El tejido puede fijarse inmediatamente después del montaje, o después del registro fisiológico y/o la inyección en bolo.
2. Enjuague el pañuelo en tampón de fosfato (PB) durante 30 min. Después de esto, el tejido puede procesarse como un montaje completo (paso 5) o cortarse en secciones verticales y luego procesarse (pasos 6 y 7).

5. Inmunotinción de Retina Enteras

1. En una placa de 24 pocillos (Figura 1D), bloquee las piezas de retina de la membrana durante 1 hora en una solución de tinción.
2. Diluir los anticuerpos primarios anti-PSD-95 de ratón 1:300 en la solución de tinción y aplicar durante 48 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Agregue ~ 100-150 μl de solución de anticuerpos en cada pocillo con el tejido. Para evitar que se sequen, llene los pozos no utilizados con agua destilada.
3. Enjuague durante 20 min en PB, 3 veces.
4. Incubar durante 24 horas en anticuerpo secundario anti-ratón Alexa 568 disuelto 1:500 en la solución de tinción.
5. Enjuague durante 20 min en PB, 3 veces.
6. Coloque el inserto con el tejido teñido en una placa de Petri estándar de 3 cm llena de solución de PB. Con unas tijeras pequeñas, corte la parte de la membrana que contiene la retina del anillo.
7. Transfiera la retina de la membrana a un deslizamiento de la retina hacia arriba. Retire el PB, agregue el medio de montaje. Coloque pequeños pedazos de un cubreobjetos roto entre el portaobjetos y los cubreobjetos para evitar apretones extensos y daños en la retina. Coloque el cubreobjetos.
8. Selle el cubreobjetos en su lugar con esmalte de uñas. Mantenga las diapositivas en la oscuridad, en un refrigerador.

6. Seccionamiento vertical de tejido montado en membrana

1. Después de la fijación, sumerja el tejido de la membrana en las soluciones de gradiente de sacarosa al 10%, 20% y 30% de sacarosa durante 30 minutos, 1 hora y toda la noche, respectivamente. El paso nocturno se realiza a 4 °C en el refrigerador, todos los demás pasos a temperatura ambiente.
2. Con unas tijeras, retire la membrana con el pañuelo del anillo de inserción de plástico.
3. Coloque la membrana cortada en Parafilm con la retina hacia arriba y retire la mayor cantidad de solución posible con Kimwipes.
4. Coloque el Parafilm con el tejido en la cámara de criostato y agregue una gota de medio OCT. Utilice el dispositivo de congelación rápida para acelerar la congelación.
5. Separe la muestra congelada y déle la vuelta.
6. Deje aproximadamente 2 mm alrededor de la muestra en tres lados, y deje 5-6 mm del lado que se unirá al soporte.
7. Cubra el lado expuesto de la retina (lado de la membrana) con una gota de OCT. Deje libre el área de fijación.
8. Congele la membrana con tejido de la retina. Ahora la muestra está lista para colocarla en un soporte de corte.
9. Coloque una gota de OCT en un anillo de soporte frío. Inserte inmediatamente la muestra congelada en la gota.
10. Corte secciones de 10-20 μm de grosor, ajustando la temperatura del criostato a -19 °C. Utilice portaobjetos de adhesión de polisina tibios (temperatura ambiente). Deje los portaobjetos con las secciones adjuntas en una plataforma de calentamiento durante ~ 2-3 min (41 ° C) en la oscuridad para garantizar una adherencia firme de las secciones.
11. Coloque los portaobjetos en una caja de almacenamiento y manténgalos a -20 °C hasta su uso.

7. Inmunotinción de secciones de retina

1. Saca los portaobjetos con las secciones del congelador. Déjalos reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto para eliminar el condensado.
2. Rodee las secciones con un bloqueador de líquidos para crear una barrera para una mayor incubación.
3. Coloque los portaobjetos en la caja de incubación. Cubra el fondo de la caja con agua para evitar la evaporación de la solución de anticuerpos.
4. Enjuague con PB durante 5 min.
5. Prepare las mismas soluciones de tinción y siga los pasos del paso 5. La incubación con el anticuerpo primario es de una noche y con el secundario de 1 hora. No utilice vidrios rotos entre el cubreobjetos y el portaobjetos.

Resultados

Aquí se muestran dos experimentos representativos que se benefician del uso de una membrana de PTFE hidrofilizada para soportar la retina entera durante los procedimientos de tinción. El primer experimento ilustra el método para la caracterización rápida y sencilla de la vasculatura de la retina, una elaborada red de vasos sanguíneos que se extienden a través de múltiples capas de la retina (Figura 2). Este enfoque combina la carga en bolo de isolectina con el marcaje por inmersión con SRH. Este es un mé...

Discusión

La alta biocompatibilidad y transparencia de la membrana de PTFE hidrofilizado en las soluciones es ventajosa cuando se trabaja con tejido vivo. Esta preparación se ha utilizado con éxito en trabajos anteriores para grabaciones de pinzas de parche de respuestas a la luz^8-10. Aquí, mostramos cómo se puede adoptar este enfoque para el análisis estructural de la retina de montaje completo.

La técnica de carga en bolo se puede utilizar eficazmente para etiquetar tejido vivo. Esta técnic...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Inserto de cultivo celular Millicell, 12 mm, PTFE hidrófilo (Biopore), 0,4 , 0,4 μ m	Millipore	PICM01250
Jeringa de insulina, 1 ml	Beckton Dickinson	309659
Tijeras Fine	Science Tools	15003-08	disección
, Dumont #55, acero inoxidable	Fine Science Tools	11255-20	disección
Cryostat	Leica	varios
Sistema de microscopio confocal	Nikon	varios
Vidrio capilar	World Precision Instruments	1B150F-4
P-97 Flaming/Brown Micropipeter Puller	Sutter Instrument Co.
Picospritzer III	Parker Hannifin
Placas de cultivo con fondo de vidrio	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
Placa de Petri	Falcon	1008
Pipetas de transferencia graduadas desechables	VWR	16001-180
Placas multipocillo, 24 pocillos	Beckton Dickinson	351147
Cubreobjetos, #1	Microscopía Electrónica Ciencias	72200-30
Portaobjetos de adhesión de polisina	Ciencias de la Microscopía Electrónica	63412-01
Portaobjetos de microscopio	Globe	1301
Bloqueador de líquidos	Ciencias de la Microscopía Electrónica	71312
Medio de montaje VECTASHIELD	Vector Laboratories	H-1000
OCT medio	Sakura	4583
Parafilm película de laboratorio	Fisher	13-374-10
Dow Corning grasa de alto vacío	Sigma-Aldrich	Z273554
Ratón anti-PSD95	Millipore	Anticuerpo MABN68
Burro antiratón Alexa 568	Invitrogen	A10037	anticuerpo
Isolectina Alexa 488	Invitrogen	I21411
Bloqueador de productos químicos	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sulforhodamina	Sigma-Aldrich	341738
Carbodiimida	Thermo Scientific	22980	EDC
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148