En comparación con la cromatografía de afinidad tradicional utilizando columnas empaquetadas de cuentas de agarosa de proteína A, los adsorbentes de membrana de proteína A pueden acelerar significativamente el aislamiento a escala de laboratorio de anticuerpos y otras proteínas que expresan fragmentos de Fc. Los métodos apropiados de análisis y cuantificación pueden acelerar aún más el procesamiento de proteínas, lo que permite que el aislamiento / caracterización se complete en un día de trabajo, en lugar de más de 20 horas de trabajo.
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Aislamiento Y Caracterización De Proteínas Quiméricas Humanas Que Expresan Fc Usando Adsorbentes De Membrana De Proteína A Y Un Flujo de Trabajo Optimizado
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Resumen
Resumen
La purificación a escala de laboratorio a escala industrial de biomoléculas de sobrenadantes de cultivos celulares y soluciones celulares lisadas se puede lograr mediante cromatografía de afinidad. Mientras que la cromatografía de afinidad utilizando perlas de agarosa de proteína A porosa empaquetadas en columnas es posiblemente el método más común de aislamiento a escala de laboratorio de anticuerpos y proteínas recombinantes que expresan fragmentos de Fc de IgG, puede ser un proceso lento y costoso. Las limitaciones de tiempo y financieras son especialmente desalentadoras en pequeños laboratorios de ciencias básicas que deben recuperar cientos de microgramos a cantidades de miligramos de proteína de soluciones diluidas, pero carecen de acceso a sistemas de administración de líquidos de alta presión y / o personal con experiencia en bioseparaciones. Además, la cuantificación y caracterización del producto también puede alargar excesivamente el tiempo de procesamiento durante varios días de trabajo e inflar los gastos (consumibles, salarios, etc.). Por lo tanto, se necesita un protocolo rápido, económico pero efectivo para el aislamiento a escala de laboratorio y la caracterización de anticuerpos y otras proteínas que poseen un fragmento de Fc. Con este fin, hemos ideado un protocolo que puede ser completado por personal técnico de experiencia limitada en menos de 9 horas (aproximadamente un día de trabajo) y tan rápido como 4 horas, en comparación con los métodos tradicionales que exigen más de 20 horas de trabajo. La mayoría del equipo requerido está fácilmente disponible en los laboratorios estándar de ciencia biomédica, bioquímica e ingeniería (bio)química, y todos los reactivos están disponibles comercialmente. Para demostrar este protocolo, los resultados representativos se presentan en los cuales el galectin-1 murine quimérico fundido al Fc humano (Gal-1hFc) del sobrenadante del cultivo celular fue aislado usando un adsorber de la membrana de la proteína A. Gal-1hFc purificado fue cuantificado usando un procedimiento occidental apresurado del análisis que borraba y caracterizado usando cytometry de flujo. El flujo de trabajo optimizado puede modificarse para otras proteínas que expresan Fc, como los anticuerpos, y/o alterarse para incorporar métodos alternativos de cuantificación y caracterización.
Introducción
El aislamiento de anticuerpos y proteínas recombinantes que expresan fragmentos de inmunoglobulina G (IgG) Fc de sobrenadantes de cultivos celulares y soluciones celulares diluidas se puede lograr utilizando cromatografía de afinidad de proteínas A. En los laboratorios de ciencia básica e ingeniería y en la industria, las columnas empaquetadas con agarosa recubierta de proteína A porosa, vidrio o perlas poliméricas se utilizan más comúnmente para la cromatografía de afinidad, a pesar de los altos costos financieros y los largos tiempos de procesamiento1-3. Es muy apreciado que la cromatografía de afinidad representa el mayor gasto y cuello de botella de procesamiento tanto en entornos de laboratorio como industriales2,4. Como resultado, se han desarrollado numerosas mejoras para disminuir el costo y el tiempo de procesamiento sin sacrificar la recuperación general del producto del tren de proceso1,2,5-7. Particularmente prometedor para el aislamiento de anticuerpos y otras proteínas que expresan Fc es la cromatografía de afinidad utilizando un adsorbente de membrana de proteína A2,5,7-10. Mientras que la captura de Fc en cromatografía de columna está limitada por difusión (esdecir, la proteína que expresa Fc debe difundirse dentro y a través de los poros internos para alcanzar la mayoría de la proteína A) con alta caída de presión a través de la columna, el transporte de masa en los adsorbers de membrana es impulsado por la convección a granel, lo que resulta en la evitación de las limitaciones de difusión8,9,11,12. Además, la caída de presión a través del adsorbente de membrana es baja, lo que permite tasas de flujo de perfusión más rápidas en comparación con las columnas empaquetadas con perlas8,9,11,12. Por lo tanto, para el aislamiento a escala de laboratorio, se predice que la cromatografía de membrana reducirá el tiempo de aislamiento en varias horas y aumentará la captura del producto en comparación con la cromatografía de columna. Además, se han propuesto modelos matemáticos para la adsorción de IgG en adsorbentes de membrana8,9,11,12,permitiendo así a los usuarios finales predecir el rendimiento en el laboratorio.
Otro cuello de botella en los laboratorios de ciencia básica e ingeniería es la caracterización de la proteína que expresa Fc. Sin embargo, la selección de métodos apropiados para completar los ensayos de caracterización, como las manchas occidentales, puede reducir en gran medida el tiempo dedicado a las pruebas de productos. Por ejemplo, la transferencia de semisido en un sistema tampón discontinuo puede lograr la transferencia electroforética de proteínas de un gel SDS-PAGE a una membrana de polivinilo difluoridina (PVDF) en cuestión de minutos, en lugar de 1-2 horas en la transferencia del tanque (húmedo) en un sistema tampón continuo13.
Un protocolo rápido, barato, y eficaz para aislar y para caracterizar una proteína quimérica de la fusión que expresa un fragmento del Fc de IgG humano se describe adjunto. La mayoría de los equipos están fácilmente disponibles en los laboratorios estándar de ciencias biomédicas básicas, biología, química y (bio)ingeniería química, y todos los reactivos están disponibles comercialmente. Aunque se generaron resultados representativos a partir del aislamiento y caracterización de una proteína de fusión quimérica Murina Galectina-1/Humana Fc (Gal-1hFc), el protocolo simplificado se puede aplicar al aislamiento de otras moléculas que poseen un fragmento Fc, como anticuerpos, fragmentos Fc ellos mismos, u otras proteínas de fusión Fc. Nuestras mejoras disminuyeron drásticamente el tiempo de procesamiento (tan solo 4 horas, pero más típicamente ~ 9 horas, en comparación con más de 20 horas de trabajo) mientras lograba una recuperación del producto similar o mejorada en comparación con los métodos estándar.
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Protocolo
1. Verificar la afinidad por la proteína A
- Verificar que la proteína que expresa Fc (proteína de fusión recombinante o anticuerpo IgG, hasta ahora denominada "proteína") tiene una afinidad aceptable por la proteína A14-17 antes de usar el adsorbente de membrana de la proteína A, y probar la presencia de la proteína en la solución madre (por ejemplo, sobrenadante de cultivo celular clarificado por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a células suspendidas de pellets). Utilice citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. para detectar la función de la proteína y/o la presencia de Fc, en función de la preferencia del laboratorio. Idealmente, cuantificar la proteína en el sobrenadante de cultivo celular (paso 6) para evitar exceder la capacidad del adsorbente de membrana de la proteína A. Proceda si se detecta la proteína.
2. Preparar la proteína A adsorbente de membrana y sobrenadante de cultivo celular
- Siga las instrucciones del fabricante para preparar el adsorbente de membrana. Nunca deje que el aire entre en el adsorbente de membrana. Todas las soluciones perfundidas a través del adsorbente de membrana deben estar a temperatura ambiente y prefiltradas utilizando un filtro de 0,22 μm. Llene una jeringa de 10 ml con solución salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco filtrada por 0,22 μm o tampón de burbujas de aire de elección y descarga. Perfundir DPBS para eliminar la solución de almacenamiento y equilibrar el adsorbente de membrana inmediatamente antes de su uso.
- Filtre el sobrenadante de cultivo celular inmediatamente antes de la perfusión a través del adsorbente de membrana, utilizando una unidad de filtración estéril de 0,22 μm impulsada por vacío.
3. Cargue el adsorbente de membrana de la proteína A
- Aspirar el sobrenadante de cultivo celular en una jeringa Luer Lock (30 ml o más) y descargar cualquier burbuja de aire.
- Montar materiales y equipos como se muestra en la Figura 1. Conecte la jeringa a la entrada del adsorbente de membrana. Conecte un tubo flexible a la salida del adsorbente de membrana. Si lo desea, coloque un filtro de jeringa de 0,22 μm entre la jeringa y el adsorbente de membrana. Use un matraz o botella para atrapar el flujo (también conocido como filtrado), del adsorbente.
- Ajuste la bomba de la jeringa a la velocidad de flujo volumétrica deseada, pero no exceda la tasa de flujo recomendada por el fabricante(por ejemplo, 10 ml / min). Perfundir el sobrenadante de cultivo celular a través del adsorbente de membrana, recogiendo el flujo a través de un castor u otro recipiente. Vuelva a cargar la jeringa con los sobrenadantes necesarios.
- Si lo desea, pruebe el flujo a través de la presencia de proteína utilizando citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. basado en la preferencia del laboratorio. Por lo general, no es necesario volver a dispersar el flujo a través de.
4. Proteína Elute del adsorbente de membrana
- Lave el adsorbente de membrana con 10 ml de DPBS para eliminar cualquier proteína no ligada.
- Proteína elute del adsorbente de membrana al caudal deseado(por ejemplo, 1 ml/min) utilizando 10-15 ml de tampón de elución(por ejemplo, tampón de elución a base de aminas (pH 2.8)). Atrapar eluido en un tubo que contenga tampón neutralizante(por ejemplo, 1 M Tris (pH 9,4)) al 10% del volumen de elución (1,0-1,5 ml).
- Alternativamente, la proteína elute en un ml se incrementa en tubos que contienen 100 μl de tampón de neutralización, utilizando un volumen total de 10-15 ml de tampón de elución. Utilice el método de caracterización preferido para probar cada fracción para la presencia de proteína.
- Regenerar el adsorbente de membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Perfundir 10 ml de DPBS filtrados a 0,22 μm o tampón de su elección, luego 10 ml de NaOH de 0,22 μm filtrados a 50 mM en 1 N NaCl, y finalmente 10 ml de DPBS filtrados a 0,22 μm. Llene el adsorbente de membrana con etanol al 20% en DPBS para su almacenamiento a largo plazo a 4 ºC.
5. Concéntrese y descongele la proteína
- Depositar todos los eluos (o fracciones de elución que contengan proteínas según lo determinado en el paso 4.3) en una unidad de filtro centrífugo de corte de peso molecular de 10 kDa. Siga las instrucciones del fabricante para la centrifugación.
- Dializar el retentado en una unidad de diálisis de pequeño volumen (corte de peso molecular de 10 kDa) contra el tampón de elección, siguiendo las instrucciones del fabricante. Es posible que sea necesario agregar un tampón al material dializado si la precipitación de proteínas es una preocupación. Si se desea, el material dializado se puede refrigerar hasta que se pueda realizar el paso 6, pero no se recomienda el almacenamiento a largo plazo sin conservantes.
6. Cuantificar y caracterizar el producto purificado en un procedimiento de western blotting acelerado
- Resolver los estándares de proteínas purificadas y Fc en el gel de elección por SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras como se desee18-20. Utilice un mini gel en lugar de gel midi para minimizar el tiempo de ejecución.
- Si aún no se conoce, determine el rango de estándares Fc en qué banda la señal varía linealmente con respecto a la cantidad de carga(por ejemplo, 0,1-1 mg). Use el mismo gel, condiciones de funcionamiento, condiciones de transferencia y reactivos que se utilizarán para cuantificar y caracterizar la proteína purificada.
- Cargue múltiples cantidades de muestras de proteína purificada, incluidas las muestras diluidas con DPBS, para asegurarse de que las señales de banda de proteína purificada estén dentro del rango de señal lineal de los estándares Fc en el análisis de imágenes.
- Transfiera proteínas del gel a una membrana de fluoruro de polivinidideno (PVDF) en un sistema tampón discontinuo utilizando un blottersemidry 13,siguiendo las instrucciones del fabricante del blotter. El tiempo de transferencia es típicamente de 5-10 min. Si se desea, Coomassie manchar el gel después de la transferencia para verificar la eficiencia de la transferencia21.
- Realizar inmunoblotting con anti-Fc o anti-IgG conjugado con fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rábano de caballo (HRP), basado en la preferencia de laboratorio, utilizando un sistema de detección de proteínas asistidas por vacío. El tiempo de immunoblotting es típicamente menos de 1 hora.
- Desarrollar immunoblot utilizando el sustrato y el método de elección(por ejemplo, sustrato AP y quimioluminiscencia mejorada).
- Cuantifique la proteína purificada por análisis de imagen. Realice una regresión lineal en las señales de banda de los estándares Fc. SiR2>0,90, utilice la ecuación de la línea para calcular la cantidad de proteínas a partir de sus señales de banda. Tenga en cuenta la dilución de la muestra si es necesario. Dado que la cuantificación de la proteína se realiza sobre la base de Fc, ajuste el valor para las diferencias de peso molecular entre la proteína y Fc. SiR2<0,90, repita el paso 6 en su totalidad.
- Validar la proteína utilizando ensayos funcionales o métodos para detectar Fc a través de citometría de flujo, Western blotting, ELISA, etc. basado en la preferencia del laboratorio.
- Diluya la proteína a la concentración deseada y/o agregue los conservantes o estabilizadores deseados a la solución de proteína purificada antes de alícuota para su almacenamiento a largo plazo, congelado o de otro tipo.
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Resultados
El protocolo simplificado para el aislamiento y la caracterización de las proteínas que expresan Fc se utiliza rutinariamente para procesar la galectina murina quimérica-1 fusionada a Fc humano (Gal-1hFc) a partir de sobrenadantes de cultivo celular diluidos. El diagrama de flujo de la figura 2 ilustra el flujo de trabajo y la hora de cada paso del protocolo. Para un lote típico de 300 ml de sobrenadante, el tiempo total de procesamiento es de aproximadamente 9 horas cuando se realiza la prueba opcional ...
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Discusión
El protocolo descrito en este documento fue desarrollado para aislar y caracterizar rápidamente una proteína quimérica de fusión que expresa fc humano (Gal-1hFc), sin comprometer significativamente la recuperación del producto o inflar el costo. Los componentes clave del flujo de trabajo optimizado son un adsorbente de membrana de proteína A para el aislamiento, y la transferencia de semisel y el inmunoblotting asistido por vacío para la caracterización por western blotting.
La disminución dra...
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Divulgaciones
No hay nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean dar las gracias al Sr. Luis F. Delgadillo (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Ohio), al Sr. Matthew H. Williams (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Ohio) y al Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital y Harvard Medical School) por su asistencia técnica experta. Los autores también desean agradecer a los estudiantes de invierno de 2011 CHE 404/BME 504 y otoño de 2012 CHE 4830/BME 5830 (Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular y Programa de Ingeniería Biomédica, Universidad de Ohio) por su asesoramiento técnico y discusión. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) Mayor Instrumentación de Investigación CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), Institutos Nacionales de Salud (NIH) NCI subvención 1R15CA161830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Beca Postdoctoral F32CA144219-01A1 (SRB), NIH / NCI R01CA173610 (CJD), y NIH NCCAM subvención R01AT004628 (CJD).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Adsorbente de membrana de proteína A (Sartobind Protein A 2 ml) | Sartorius-Stedim | 93PRAP06HB-12--A Filtro | |
| centrífugo Amicon Ultra, 10 kDa, 4 ml | Millipore | UFC801008 | Utilice un volumen de 15 ml si es necesario |
| Unidad de filtro de vacío estéril, 0,22 y micro; m, 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| 10 ml Jeringas con puntas Luer Lock | BD 301604 | ||
| 30 ml Jeringas con puntas Luer Lock | BD | 309650 | |
| Tubo de laboratorio Tygon (1/16 pulgadas x 1/8 pulgadas x 50 pies) | Cole Parmer | WU-95903-16 | |
| Dispositivos de diálisis Slide-A-Lyzer MINI (10K MWCO) | Thermo Scientific | 69576 | |
| Snap i.d. bandeja de recolección de anticuerpos | EMD Millipore | WBAVDABTR | |
| Snap i.d. soporte de transferencia de pocillo único | EMD Millipore | WBAVDBH01 | |
| Tampón de elución | Thermo Scientific | 21004 | |
| Tris, ultrapuro | Fisher Scientific | 819623 Cloruro | |
| de sodio | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| DPBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| DPBS con Ca2+/Mg2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Humano Fc | Bethyl Laboratorios de Investigación | P80-104 | |
| Antihumano Fc-APC | Jackson Immunoresearch | 109136170 | |
| Anti-humano Fc-AP | Bio-Rad | 170-5018 | |
| Sustrato de fosfatasa alcalina | Promega | S3841 | |
| Tubos de citometría de flujo (5 ml de poliestireno o polipropileno) | BD | 352054 | |
| Bomba de jeringa | Harvard Apparatus | 55-2226 | También es aceptable una bomba peristáltica |
| Gel de proteínas sistema de electroforesis | Bio-Rad Laboratories | 552BR094876 | Cualquier sistema de electroforesis en gel es aceptable, pero los sistemas de mini gel funcionan más rápido |
| Secante semiseco | Bio-Rad Laboratories | 690BR006163 | Cualquier sistema de transferencia es aceptable, pero los sistemas de transferencia discontinuos realizan la transferencia electroforética más rápida |
| Sistema de detección de proteínas asistido por vacío SNAP i.d. | EMD Millipore | WBAVDBASE | Un modelo actualizado ha reemplazado a este instrumento específico, pero cualquiera de los dos debería funcionar igual de bien |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
