Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Resumen

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado. Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Resumen

Muchos tejidos, tales como los corazones humanos adultos, no son capaces de regenerarse adecuadamente después de un daño. ^2,3 Estrategias en la ingeniería de tejidos proponen innovaciones para ayudar al cuerpo en la recuperación y reparación. Por ejemplo, los enfoques de TE pueden ser capaces de atenuar la remodelación cardiaca después de infarto de miocardio (MI) y, posiblemente, aumentar la función total del corazón a un nivel casi normal pre-MI. ⁴ Como con cualquier tejido funcional, regeneración exitosa del tejido cardíaco implica la correcta entrega de los múltiples tipos de células con señales ambientales que favorecen la integración y la supervivencia del injerto de células / tejido implantado. Tejidos reconstituidos deben abordar varios parámetros, entre ellos: señales solubles, interacciones célula a célula, y materiales de matriz evaluados como vehículos de administración, sus efectos sobre la supervivencia celular, la resistencia del material, y la facilitación de la organización de la célula a los tejidos. Los estudios que emplean la inyección directa de células del injerto sólo ignorar estos elementos esenciales. ^2,5,6Un diseño tejido combinando estos ingredientes todavía no se ha desarrollado. A continuación, presentamos un ejemplo de diseños integrados que utilizan capas de láminas de células estampadas con dos tipos distintos de materiales de origen biológico que contenga el tipo de células de órganos diana y las células endoteliales para la mejora de la formación de nuevos vasos en el "tejido". Aunque estos estudios se centran en la generación de tejido de corazón-como, este diseño de tejido se puede aplicar a muchos otros órganos además de corazón con diseño y el material cambios mínimos, y está destinado a ser un producto fuera de la plataforma para las terapias regenerativas. El protocolo contiene cinco pasos detallados. Una temperatura de poli sensible (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) se utiliza para platos de cultivo de tejidos abrigo. Luego, las células específicas de tejidos se cultivan en la superficie de las placas recubiertas / superficies micropatrón para formar láminas de células con fuertes adherencias laterales. En tercer lugar, se crea una matriz de base para el tejido mediante la combinación de matriz porosa con admisible que neovascularhe hidrogeles y células endoteliales. Finalmente, las láminas de células se levantan de los platos recubiertos PNIPAAm y se transfieren al elemento de base, por lo que la construcción completa.

Introducción

La inyección de células y/o materiales individuales por sí sola ha mostrado un éxito variable en otros sistemas de órganos y un éxito limitado en la regeneración cardíaca. ^5,7-12 En la actualidad, las células derivadas de células madre se administran al tejido dañado utilizando una variedad de métodos de administración que incluyen: inyección directa de células en el tejido y perfusión en el suministro de sangre. ^13-17 Otros han implantado células solas, materiales solos y/o en combinación con portadores de materiales para ayudar a regenerar los órganos dañados. ^18-21 Este diseño combina múltiples estrategias que proporcionan resistencia del material, patrones en múltiples materiales y múltiples tipos de celdas.

Específicamente, la matriz fibrosa acelularizada base proporciona la fuerza física fundamental al constructo, lo que lo hace adecuado para suturar en el paciente, si es necesario. Los espacios vacíos en la matriz base se llenan con células endoteliales en un hidrogel permisivo neovascular²² para establecer rápidamente la vascularización de la construcción implantada. Este compuesto se integra con láminas de células premodeladas que permiten una mejor comunicación de célula a célula, imitando más de cerca el tejido nativo. ^{1,23-25 El proceso general de} producción del parche celular en capas se describe en el diagrama de flujo de la Figura 1.

Protocolo

1. Creación de placas recubiertas con PNIPAAm

1. Disolver el 2,6 g de PNIPAAm en 2 ml de una solución de hexano 60% de tolueno / 40%.
2. Se calienta la mezcla a 60 ° C durante 10 min con agitación, hasta que se disuelva el PNIPAAm.
3. Cortar el papel de filtro en un círculo de diámetro 60 mm y coloque el papel en el embudo Buchner.
4. Se filtra la solución a través de un embudo Buchner en el vaso de vidrio previamente pesado (no utilice plásticos, como el hexano se derretirá plásticos).
5. Colocar el vaso y su contenido en un vacío de campana (24 psi) O / N (16 horas). Nota: Hasta que el residuo se hace reaccionar con isopropílico se oxidará así que asegúrese de que no entre en contacto con el oxígeno.
6. Pesar el vaso de precipitados para establecer el peso de la PNIPAAm.
7. Añadir alcohol isopropílico a la PNIPAAm, la creación de un 50/50 w / w solución.
8. Coloque 2 ml de la solución en la superficie de la placa de cultivo de tejidos, y el abrigo durante 5 minutos bajo luz UV.
9. Lavar la placa con 2 ml de PBS caliente dos vecesantes de usar para el cultivo celular.

2. Creación de láminas de células

Nota: láminas de células de células primarias para el órgano diana pueden ser creados usando un número de diferentes métodos, o mediante el recubrimiento de superficies de cultivo de tejidos con el polímero termosensible tal como se describe aquí. Placas termo-sensible Pre-recubiertos también son ofrecidos por varios proveedores.

Nota: Este protocolo es para la cultura utilizando una placa de 35 mm. Brevemente, las células se incubaron primero a 37 ° C durante un mínimo de 24 horas a confluencia de establecer conexiones laterales entre las células adyacentes. Para separar las hojas de células, las placas se someten a temperaturas inferiores a 32 ° C. La lámina de células se transfiere a continuación a la fuerte matriz fibrosa de base que contiene un hidrogel permisiva neovascular con las células endoteliales vasculares.

1. Aislar la población celular. Nota: Este método depende de los procedimientos de derivación individuales y el tipo de células. Rata mu lisa aórticacélulas SCLE (RASMC) se utilizan en este ejemplo. Estos son células musculares lisas primarias aisladas de la aorta abdominal de una rata.
2. Lavar las células con 2 ml de PBS caliente.
3. Añadir 3 ml de tripsina (u otra solución de escisión / disociar) a las células durante 5 min.
4. Inhibir la tripsina mediante la adición de 3 ml de los medios de cultivo, o una solución de tampón fosfato (PBS) que contenía 10% suero bovino fetal (FBS).
5. Recoger las células en un tubo cónico y contar una alícuota.
6. Girar las células a 1.000 rpm (228 xg) durante 5 min.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en su medio de crecimiento (medio de cultivo SmGM2 más kit de bala se utiliza para RASMC).
8. Coloque el soporte que contiene las células en un termo-sensible placa de 35 mm - PNIPAAm placa recubierta con una concentración que permitirá alcanzar el 100% de confluencia. Nota: Para RASMCs ese número se determinó que era de 100.000 células / cm ^2. Sin embargo, debido a la pérdida de células durante el paso, 120% de que va se utiliza Lue.
9. Coloque en una incubadora a 37 ° CO / N. Nota: Es importante mantener las células a 37 ° C para mantener la adhesión de células a la placa.

3 Preparación de Matrix Foundational

Nota: Varias matrices fibrosas 3D se pueden utilizar para la capa matriz fibrosa fuerte entre las láminas de células delicadas. Algunos ejemplos incluyen: espuma de gel, bioglass, materiales naturales acellularized ²⁶ o nanospun materiales ^27,28 La matriz de la vejiga urinaria porcino (UBM) utilizado en estos estudios fue proporcionado generosamente de nuestro colaborador, el Dr. Badylak ^29.

1. Antes de usar, determinar las características de la matriz, incluyendo la falta de contenido celular si se utiliza matriz descelulariza, ^27,28 viabilidad de células específicas, y el espacio vacío. ²²
2. Cortar la matriz de pre-esterilizados en un tamaño y forma deseados. Nota: Aquí, una perforadora se utiliza para cortar un círculo de diámetro 4 mm.

ve_title "> 4. células endoteliales Siembra en un neovascular permisivo hidrogel

Nota: Las células endoteliales se pueden obtener de una variedad de fuentes, incluyendo la diferenciación de las células madre o progenitoras. En este caso, se utilizan las HUVEC.

1. Utilice cualquier hidrogel permisiva (fibrina, geles de colágeno), siempre y cuando el tiempo de reticulación es suficientemente corto como para permitir que las células permanecen viables. Nota: En este caso, un gel de ácido hialurónico (HA), basado reticulado se utiliza con un puente disulfuro.
2. Preparar el hidrogel HA de acuerdo con el protocolo de empresa.
3. Recoger las células endoteliales y se dispersan en una solución de una sola célula utilizando tripsina 1x. Nota: Accutase o tampón de disociación celular también podrían utilizarse para la dispersión de células individuales.
4. Desactivar la enzima tripsina mediante el uso de una cantidad igual de inhibidor de tripsina de soja (si es importante que las células no entran en contacto con suero) o 10% de FBS en PBS, recogiendo la solución / células en un tubo cónico de 15 ml.
5. Cporte de las células, y calcular el volumen necesario para las dimensiones del parche (previamente cuantificados). Nota: Para obtener un parche de 4 mm, se utilizan aquí de 2 millones de células endoteliales.
6. Extraer 2 millones de células, y colocarlo en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
7. Haga girar al (228 xg) durante 5 min.
8. Aspirar el sobrenadante, dejando las células como sedimento en un tubo cónico.
9. Mezclar los materiales líquidos de HA y gelatina en una ración de 1: 1. A continuación, añadir 80% del volumen total en el tubo cónico que contiene el sedimento.
10. Resuspender las células endoteliales en la 1: / mezcla de gelatina 1 HA
11. Colocar las células en suspensión en la mezcla de HA / gelatina en la base de matriz fibrosa de la Etapa 2.
12. Añadir un quinto (20 por ciento) del volumen total deseado de la reticulante
13. Incubar durante 1 hora a 37 ° C.

5. Aislamiento de láminas de células

1. Retire las placas tratadas con PNIPAAm 35 mm que contienen las células de la incubadora y el lugar en una campana de cultivo celular aRT.
2. Aspirar rápidamente el medio de las células, y añadir 2 ml de 6% de gelatina normal que se ha calentado a 37 ° C.
3. Mientras que la gelatina está todavía caliente, coloque la retícula de metal en la gelatina, sumergiéndolo debajo de la superficie de la gelatina normal (Película 1).
4. Toda la placa sobre hielo durante 5 a 7 minutos, lo que permite que la gelatina se endurezca.
5. Después de 7 min, utilizar una espátula para separar cuidadosamente los bordes de gelatina desde el lado de la placa, y luego usar fórceps para levantar la retícula de metal de la placa Nota: La gelatina 6%, y la lámina de células debe levantar con la red.
6. Mueva la lámina de células a la placa y se coloca en la parte superior de la combinación de matriz de hidrogel de base fibroso, estableciendo cuidadosamente la red en la parte superior de la construcción. Nota: El lado apical de la lámina de células todavía estará en la posición superior.
7. Añadir 2 ml de medio caliente (37 ° C).
8. Incubar O / N permitiendo que la lámina de células para adherirse a la superficie del hidrogel.
9. Retire tretícula de metal después de que la solución se calienta (aproximadamente 1 hora), o al día siguiente.

Resultados

El diagrama de flujo (Figura 1) muestra el método general de hacer que el parche de varias capas. Láminas de células se separan de la placa tratada PNIPAAm dejando caer la temperatura por debajo de 32 ° C. A continuación, la lámina de células se coloca en la parte superior del hidrogel reticulado que contiene las células endoteliales sembradas en la matriz fibrosa subyacente (Figura 1). Las placas termo-sensible pretratados también se pueden utilizar para crear las láminas de células. S...

Discusión

Los pasos críticos en el protocolo incluyen: el revestimiento de las superficies de la placa con el polímero termosensible y la manipulación de las láminas de células después de enfriar las placas. Debido a que diferentes células exhiben diferentes propiedades físicas, como la adhesividad, el tiempo de elevación debe ser optimizada para cada tipo celular diferente. El segundo, y más desafiante significativamente componente de este protocolo, se centra en la manipulación de la capa celular, un aspecto crítico de los méto...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reagents
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Rastreador celular / colorante vivo
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Rastreador celular
Rojo neutro	Sigma	N7005	Colorante celular visible
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Tolueno	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexano	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Células de músculo liso aórtico de rata
SmGM2	Lonza	CC-4149	Medios de músculo liso
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Células endoteliales venosas humanas
HyStem	Glycosan/ Biotime
Alcohol isopropílico	VWR International	BDH1133-4LP
Tripsina	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Specific Equipment
Papel de filtro	Ahlstrom	6310-0900
Embudo de Buchner	Sigma Aldrich	Z247308
Placas UpCell	Nunc	2014-11
Luz ultravioleta	Jelight Company	Limpiador UVO Modelo No.42