Un Protocolo de Respuesta de probóscide Extensión para la Investigación de la plasticidad de comportamiento en Insectos: Aplicación a Basic, Biomédica y de Investigación Agrícola

Resumen

El protocolo de acondicionamiento de la Respuesta de Extensión de la Probóscide (PER), desarrollado para la abeja melífera (Apis mellifera), proporciona un medio ecológicamente relevante y fácilmente cuantificable para estudiar varios mecanismos diferentes de aprendizaje en muchas especies de insectos.

Resumen

Insectos modifican sus respuestas a los estímulos a través de la experiencia de la asociación de esos estímulos con los acontecimientos importantes para la supervivencia (por ejemplo, alimentos, compañeros, amenazas). Hay varios mecanismos de comportamiento a través del cual un insecto aprende asociaciones sobresalientes y los relaciona con estos eventos. Es importante entender esta plasticidad conductual para los programas encaminados hacia la asistencia a los insectos que son beneficiosos para la agricultura. Esta comprensión también se puede utilizar para descubrir soluciones a los problemas biomédicos y agrícolas creadas por los insectos que actúan como vectores de enfermedades y plagas. La respuesta de Extensión probóscide (PER) protocolo acondicionado fue desarrollado para las abejas de miel (Apis mellifera) hace más de 50 años para estudiar cómo perciben y aprender acerca de los olores florales, que señalan los recursos de néctar y polen a las necesidades de colonias para la supervivencia. El procedimiento PER proporciona un marco sólido y fácil de emplear para el estudio de varios diferentes mecha ecológicamente relevantenismos de la plasticidad de comportamiento. Es fácilmente adaptable para su uso con varias otras especies de insectos y otros reflejos de comportamiento. Estos protocolos pueden ser fácilmente empleados en conjunto con diversos medios para el seguimiento de la actividad neuronal en el SNC a través de electrofisiología o bioimagen, o para la manipulación de las vías de neuromoduladores específicos. Es un sólido ensayo para detectar rápidamente efectos subletales sobre el comportamiento causado por factores de estrés ambientales, toxinas o pesticidas.

Mostramos cómo el protocolo PER es sencillo de implementar el uso de dos procedimientos. Uno de ellos es adecuado como un ejercicio de laboratorio para estudiantes o para ensayos rápidos del efecto de un tratamiento experimental. El otro proporciona más control exhaustivo de variables, que es importante para los estudios de condicionamiento conductual. Se muestra cómo varias medidas para la respuesta de comportamiento que van desde binarios sí / no a más variable continua como la latencia y duración de la trompa de extensión se puede utilizar para probar hypotheses. Y, discutimos algunas trampas que los investigadores suelen encontrar cuando utilizan el procedimiento por primera vez.

Introducción

Muchos insectos aprenden sobre estímulos ecológicamente pertinentes, y luego cambiar sus respuestas de comportamiento a los estímulos con el fin de adaptarse a las nuevas relaciones predictivas en su entorno. Varios mecanismos diferentes pueden ser la base de esta plasticidad de comportamiento (por ejemplo, no asociativo, asociativo / pavloviano y operante / instrumentales ^1). Este tipo de plasticidad difieren en cómo los estímulos o comportamientos están asociados con eventos importantes, tales como la aparición de la comida, un compañero, o peligro. La comprensión de estas formas de plasticidad es muy importante para la investigación básica sobre cómo el sistema nervioso cambia de codificar nuevos recuerdos ^2. También es importante para la comprensión de los comportamientos de adaptación de los insectos que son importantes vectores de la enfermedad (por ejemplo, la mosca tsetsé y los mosquitos) e insectos que son importante para la agricultura, ya sea en la producción de cultivos (abejas) o como plagas.

El estudio de la plasticidad de comportamiento en cualquier animal requiere un nivel de control experimental sobre un número de variables que no se puede lograr en el campo ^1. Se requiere el desarrollo de un protocolo robusto acondicionado que pueden ser empleados en condiciones más controladas, pero que aún son relevantes para el comportamiento en condiciones naturales. La abeja de la miel (Apis mellifera) es un excelente modelo de cómo desarrollar un protocolo para la realización de análisis controlados de ^3,4 plasticidad conductual. La respuesta de Extensión probóscide (PER) en las abejas de miel es un reflejo del comportamiento natural en el que la abeja de la miel se extiende su probóscide en respuesta a la estimulación de las antenas con una solución de azúcar. Durante comportamiento de alimentación normal, PER se produce cuando la abeja de la miel se encuentra el néctar en una flor. Afortunadamente, las abejas exhibirán fácilmente este comportamiento simple y fácilmente cuantificable en el laboratorio. Esto hace que sea posible estudiar, en un entorno controlado, los mecanismos que influyen en este comportamiento ecológicamente relevante ^5. POR can también ser utilizado dentro de un protocolo acondicionado para investigar la percepción del estímulo y el aprendizaje y la memoria bajo diferentes condiciones de tratamiento, que están diseñados para revelar los mecanismos de comportamiento y neuronales que subyacen a la plasticidad ^6.

Desde los primeros estudios realizados por Kuwabara ^7, PER acondicionado ha sido ampliamente utilizado para revelar no asociativo, asociativo y mecanismos operantes que subyacen a la plasticidad de comportamiento en las abejas melíferas ^8. Estos mecanismos son idénticos a los revelados en los estudios de abejas de la miel que vuelan libremente ^9. A diferencia de los estudios de las abejas que vuelan libremente, protocolos de acondicionamiento POR pueden acoplarse con la electrofisiología ^10,11 o de células vivas imágenes de fluorescencia ^12-14 del cerebro. Además, los protocolos POR permiten la manipulación experimental de las vías nerviosas a través de tratamientos farmacológicos o genéticos moleculares para probar hipótesis acerca de los roles de los componentes específicos de la red, tales como neuromodulators ^15,16. Protocolos PER también han proporcionado una forma importante para evaluar los efectos subletales de las condiciones ambientales, así como las toxinas en la salud y la eficiencia de forrajeo de las abejas ^17.

Este procedimiento describe dos métodos de entrega olor en paralelo. Método 1 es una versión del olor y estímulo no condicionado (sacarosa) de entrega que proporciona un método económico y técnicamente sencillo para presentar el olor y sacarosa recompensa. Este método es bueno para la formación básica y cuando la automatización no es posible. Es una excelente manera de introducir esta técnica a un laboratorio de clase o la enseñanza. Durante acondicionado para experimentos que implican tareas más difíciles y evaluaciones fisiológicas acopladas de la percepción del olor, el aprendizaje o la memoria, es muy importante para regular con exactitud y precisión el inicio, el tiempo de entrega duración de los estímulos. Para la entrega de estímulos más confiable, utilizar un medio de la automatización de la entrega de un olorencontrar un método preciso de entrega recompensa. Método 2 emplea automatizado de entrega olor y entrega sacarosa más precisa. Es técnicamente más sofisticado y requiere más para la configuración inicial del método 1, pero aumenta significativamente la coherencia del calendario y la cantidad de estímulos utilizados para el acondicionamiento y debe utilizarse siempre que sea posible.

Protocolo

1. Olor Configuración Cartucho (estímulo condicionado)

1. Al principio del experimento, la configuración de múltiples cartuchos de olor para todos los diferentes olores necesarios para los ensayos de condicionamiento.
   1. Use una campana extractora para la dilución de olores y preparación cartucho olor. Nunca botellas abiertas de olores fuera de esa campana de extracción, ya que los olores se extendió rápidamente por todo el laboratorio y potencialmente exponer a las abejas al olor antes de acondicionado. Además, use guantes mientras que la creación de los cartuchos de olor y lavar a fondo después para evitar la exposición de las abejas a olores durante la manipulación de ellos.
   2. Asegúrese de que cada cartucho de olor está claramente marcada con una etiqueta con código de color del olor para el que se utilizó por primera vez. Nunca use un cartucho de olor (cilindro de la jeringa o émbolo) para más de un olor, ya que puede haber olor residual en el cartucho.
2. Olores Preparación y olor Mezclas
   1. Diluir olores, ya sea en hexano o aceite mineral para el dconcentración esired.
      NOTA: La alteración de la concentración del olor o presentar mezclas de dos o más sustancias odoríferas pueden permitir la investigación de aspectos adicionales de cómo las abejas perciben olores y aprenden la asociación acondicionado. Mezclas de olor puede ser tan simple como una mezcla binaria 50:50 o tan complejo como varios olores que imitan estímulos olfativos naturales. La reducción de la concentración del olor también aumenta la dificultad de la tarea.
      1. Los olores se agotará con la reutilización del cartucho (Figura 2). Para evitar problemas de agotamiento hacen suficientes cartuchos para ser capaz de cambiar a un nuevo cartucho cada 10-12 utiliza.
3. Preparación de olor Cartuchos
   1. Método 1
      1. Para este método, utilizar jeringas de plástico 20 ml con un círculo de diámetro 15 mm de papel de filtro fijado a la goma del extremo del émbolo para los cartuchos de olor.
      2. Retire el émbolo de la jeringa y utilizar un alfiler para sujetar la pieza de FILTEr de papel al extremo del émbolo.
      3. Utilizar una micropipeta para colocar 10 l de la olor en el papel de filtro, y vuelva a insertar el émbolo en el cilindro de la jeringa. Empuje el émbolo hasta la marca de 15 ml en el cilindro de la jeringa.
   2. Método 2
      1. Para este método, utilizar vidrio de 1 cc o jeringas de tuberculina de plástico (o pipetas modificadas de volumen similar y forma) con una tira de papel de filtro en el interior y un restrictor de caucho o silicona en el extremo ancho del cuerpo de la jeringa para los cartuchos de olor.
      2. Retire el émbolo de una jeringa de 1 cc tuberculina barril. El barril de la jeringa será el cuerpo del cartucho olor.
      3. Retire la punta de goma negro del émbolo de la jeringa y cortar el extremo cerrado de la punta de goma.
         NOTA: Este anillo de goma actúa como un limitador para reducir la succión del flujo de aire en la arena, que prematuramente dibujar olor fuera del cartucho y sobre la abeja de la miel contenida. Alternativamente, el tubo de silicona (4,8 mm outer diámetro) se corta en secciones de 5 mm funciona como restrictores.
   3. Enjuague el interior del cilindro de la jeringa y el restrictor de goma / silicona con etanol al 70% (para eliminar la mayor parte del olor residual de un uso anterior) y dejar secar al aire.
   4. Coloque una tira de 0,2 x 4 cm de papel de filtro en la amplia apertura del barril para que el papel se extiende 1-2 cm más allá de la abertura.
   5. Utilizar una micropipeta para colocar 3-10 l del olor en el papel de filtro sin dejar que el olor toque el extremo del cilindro de la jeringa. La punta de la pipeta se puede reutilizar para el mismo olor, pero asegúrese de utilizar una punta nueva para configurar el siguiente olor.
   6. Girar la amplia apertura del cilindro de la jeringa hacia arriba de modo que el papel de filtro se desliza rápidamente en el tubo. Insertar el restrictor en la amplia apertura del tubo de la jeringa.
      1. Asegúrese de que cada cartucho de olor está claramente marcada con una etiqueta con código de color del olor que se utilizó por primera vez para. Nunca use un cartucho de olor (tubo de la jeringa o restrictor) para más de un olor, ya que puede haber olor residual en él.
   7. Bola hasta el final de un paño libre de pelusa, remoje con 70% de etanol, y lo utilizan para limpiar a fondo la superficie exterior del cartucho para eliminar cualquier olor residual en la parte exterior del cartucho.

2. Recogida, Retener, y Feeding the Bees

1. Preparación Bee restricción Arneses
   1. Hacer arneses de sujeción simples para las abejas de miel de pajitas de plástico de soda, un tubo de plástico duro, o tubos de metal mecanizado (todos son aproximadamente 0,9 cm de diámetro interno y tienen espesor de pared 1.2 mm). Utilice arneses más resistentes para los procedimientos quirúrgicos.
   2. Cortar 3 cm secciones de la tubería. Entonces, parcialmente recortar aproximadamente la mitad de la parte superior 1 cm del arnés para que sea más fácil de sujetar la abeja en su lugar mientras la fijación del arnés.
   3. Cortar una tira de 0,2 x 6 cm de cinta adhesiva y conecte un extremo a un lado del arnés de abeja, leaving el otro extremo libre.
2. Recogida de Abejas de trabajador
   1. Recoge los trabajadores de la entrada a la colonia, ya que una pausa antes de salir de la colonia o cuando regresan de forrajeo.
      NOTA: Colocar un pedazo de malla de alambre, con agujeros lo suficientemente grandes para las abejas obreras a través de rastreo, sobre la entrada ralentiza los trabajadores que regresan hacia abajo y hace que sea más fácil capturarlos antes de que entren a la colonia.
   2. Coloque un vial de centelleo sobre la abeja hasta que vuela en ella. Sujete el vial con su abertura horizontal o hacia abajo mientras que la tapa se sujeta por lo que la abeja no vuela arriba fuera del vial. Coloque sólo una abeja en cada vial. Asegúrese de que la tapa tiene un agujero en él para permitir el intercambio de gases adecuado.
   3. Recoge las abejas rápidamente para minimizar el tiempo que pasan en los viales. Colocar los viales con las abejas en ellas en una pequeña caja en la sombra.
   4. Transferir la caja con los viales y las abejas al laboratorio, y coloque los viales en una sl-agua heladaUrry hasta que las abejas dejan de moverse. Una vez que una abeja es inmóvil, retire el vial del hielo inmediatamente para evitar la sobreexposición al frío, y coloque la abeja en un arnés de restricción.
      NOTA: No se recomienda la colocación de las abejas en el refrigerador o en el congelador, ya que es difícil de controlar cuando las abejas se vuelven inmóviles, dando lugar a la exposición excesiva al frío. Cuando el aprovechamiento de más de 10 abejas, transferir sólo unas pocas abejas a la suspensión de agua con hielo a la vez.
3. Restringir las abejas
   1. Coloque la abeja en el arnés con su tórax dorsal frente a la parte en corte de la tubería y la cabeza justo encima de la parte superior de la tubería. Presione suavemente la abeja cerca de la tubería por lo que sus piezas bucales se extienden más allá del borde del tubo. Deslizar la tira de cinta adhesiva en entre la cabeza y el tórax en el lado dorsal de la abeja y fije firmemente el extremo libre hacia el lado del arnés.
      1. Asegúrese de que la cinta del arnés es suave y tersa. No debería haber ninguna notificaciónlagunas ceable entre la parte delantera del arnés de abeja y la cinta, y la cinta debe quedar plana en la parte superior del arnés. Si hay huecos que la abeja puede no ser capaz de extender su probóscide correctamente o puede escapar. Además, asegúrese de patas delanteras de la abeja no sobresalen entre la parte frontal del arnés y la cinta adhesiva.
4. Alimentar a las abejas y la alimentación a intervalos acondicionado
   1. A unos 30 minutos después de aprovechamiento - después de las abejas se han recuperado de la configuración inicial - alimentar a las abejas 3.4 l 0,5 M de sacarosa (en agua). Esta cantidad será suficiente para un intervalo de 3-4 horas en periodo de-al condicionamiento.
      1. En general, alimentar a 1 l de 0,5 M de sacarosa aproximadamente cada hora de tiempo de espera entre la alimentación y el acondicionamiento para asegurar que las abejas sobrevivan el intervalo aún son lo suficientemente hambre a principios del condicionamiento que estar motivados para aprender la asociación acondicionado. En un laboratorio mantenido a una temperatura caliente o si ucantar una concentración diferente de sacarosa, ajustar la cantidad de alimento o el intervalo de tiempo en consecuencia.
         NOTA: Con una alimentación de intervalo de acondicionamiento de las 24 horas, asegúrese de que todas las abejas se alimentan hasta la saciedad con 0,5 o 1 M sacarosa al menos 24 horas antes de que comience acondicionado. A temperatura ambiente, las abejas requieren aproximadamente 24 horas antes de que se lo suficientemente motivado para responder bien en un protocolo acondicionado.
         NOTA: Utilice una menor concentración de solución de sacarosa para la alimentación de las abejas que la concentración usada como una recompensa durante el acondicionamiento para evitar que las abejas se convierta en menos sensible a la concentración de sacarosa utilizado durante el acondicionamiento, lo que puede reducir el rendimiento de aprendizaje ^18.
      2. Alimentar a las abejas en una zona alejada de la zona de entrenamiento. La exposición al estímulo no condicionado (sacarosa) en el contexto acondicionado antes de acondicionado podría influir en la posterior acondicionado para el olor.
   2. Durante el intervalo entre la alimentación y Conditioning colocar las abejas en el mostrador en una zona tranquila del laboratorio para evitar molestias innecesarias. Si el laboratorio tiene baja humedad ambiente, colocar las abejas en un recipiente de plástico con toallas de papel húmedas durante el intervalo de tiempo. Esto evita la desecación, ya que las abejas pueden morir si están expuestos a la humedad baja durante períodos de tiempo prolongados.
      NOTA: No cambie el protocolo de captación y alimentación dentro de un experimento! Utilice sólo un intervalo de tiempo específico entre la configuración y la alimentación de las abejas y comenzando acondicionado para cada experimento para que las abejas son tratados exactamente de la misma manera.

3. acondicionado

1. Las pruebas de sacarosa Sensibilidad
   1. Unos minutos antes de comenzar acondicionado, probar la motivación de las abejas para alimentar al tocar sus antenas con una pequeña gota de solución de sacarosa 0,5 M (la misma concentración utilizada durante la alimentación). No permita que se alimentan durante esta prueba. Si ellos responden exteNding su probóscide, que probablemente son lo suficientemente motivados para aprender y pueden ser utilizados para el protocolo.
2. Diseño Experimental
   NOTA: Este protocolo puede ser modificado para adaptarse a una amplia gama de protocolos de aprendizaje con el fin de investigar muchos aspectos de las capacidades de aprendizaje y memoria miel de abeja. Entre los muchos parámetros que se pueden ajustar son el: intervalo de Inter-ensayo, el número de abejas entrenadas en un momento dado, el intervalo entre estímulos, el tipo y la concentración y la cantidad de olores, el tipo y la concentración del estímulo incondicionado, el número y la secuencia de los ensayos (Figura 1, Tabla 1) ^19-21. Al diseñar el protocolo exacto para cada ensayo de condicionamiento, es muy importante mantener el intervalo entre pruebas consistentes a través de los individuos. Un intervalo de prueba, entre que es demasiado corto, demasiado largo o inconsistente perjudicará el rendimiento de las abejas. Véase la discusión para un tratamiento completo de este tema.
   NOTA: Bees aprenderán la tarea con mayor rapidez si se encuentran en un ambiente cálido. Por lo tanto, mantener la temperatura del ambiente de entrenamiento consistente y caliente (29-30 ° C si es posible).
3. Entregando el olor (estímulo condicionado)
   1. Método 1
      1. Configuración del Sistema Olor Entrega
         1. Monte la jeringa de plástico de 20 ml que contiene el papel filtro de olores tratados por lo que es estable y el extremo pequeño se enfrenta directamente a las antenas de la abeja. Establecer el émbolo en la marca de 15 ml y colocar la jeringa de modo que el émbolo es de fácil acceso.
      2. La presentación de los Estímulo de olor
         1. Al comienzo de cada ensayo, colocar la abeja en el arnés en la clavija en la arena acondicionado con sus antenas apuntan directamente hacia el cartucho de olor. Deje que la abeja se aclimate a la arena por 15-25 segundos antes de comenzar el estímulo de olor para reducir los problemas ocasionados por el cambio abrupto en su entorno visual durante el estímulo de olor.
            1. Si la abeja comienza a responder al cartucho olor inmediatamente después de que se coloca en la arena acondicionado, puede haber olor en la punta del cartucho. Quitar el olor contamine lavando el cartucho con un paño sin pelusa humedecido en etanol al 70%. Si eso no resuelve el problema, sustituya el cartucho.
         2. Presione el émbolo de la jeringa a una velocidad constante de modo que el émbolo está completamente deprimido dentro de 4 seg. Monitorear la respuesta de la abeja para el olor antes de presentar el estímulo incondicionado.
         3. Después de cada ensayo, permita que la abeja para descansar en la arena acondicionado para otro 15-25 seg. Mover la abeja demasiado pronto después del juicio reducirá significativamente la eficacia de cada ensayo de condicionamiento.
   2. Método 2
      1. Configuración del Sistema Olor Entrega
         1. El flujo de aire Fuente y Caudal
            1. A medida que el flujo de aire fuente de entrega de olorutilizar una bomba de acuario o aireador un suministro de aire presurizado banco de laboratorio, si el laboratorio está equipado con él.
               NOTA: Una bomba aireador de acuario típico tendrá una tasa de flujo de aire cerca de 400 ml / min (7 ml / seg); el 4 seg olor estímulo, 28 ml de aire fluirán a través de un cartucho de 1 ml.
            2. Utilice un medidor de flujo en línea con el tubo del aparato de suministro de aire para regular la velocidad de flujo para el suministro de aire. Ajuste el medidor de flujo hasta que la tasa de flujo es de 400 ml / min. Compruebe la velocidad de flujo en la abertura del cartucho de olor con un medidor de flujo separado.
            3. Conectar el flujo de aire al cartucho de olor a través de un sistema de tubo de plástico y las válvulas.
               NOTA: El dispositivo de tiempo se discute más adelante abre las válvulas en el momento apropiado en el ensayo. Conectores de plástico se adhieren al sistema de flujo de aire en el cartucho de olor a través de un tipo de archivo adjunto Luer de la jeringa barril del cartucho.
            4. Independientemente de la fuente de flujo de aire, comprobar el caudal periódicamente para make de que la línea está intacto y la velocidad de flujo se mantiene a la velocidad deseada.
      2. Automatizado Olor Entrega
         1. Utilice un controlador lógico programable (PLC) para automatizar la entrega del olor.
            NOTA: El PLC está programado para abrir las válvulas a la entrega olor flujo de aire 6 segundos después de iniciar el programa (iniciado pulsando un botón), mantener las válvulas abiertas durante 4 segundos, y que suene una señal audible de alimentación, a través de un pequeño altavoz, 3 segundos después de la aparición de olor estímulo para señalar el experimentador para entregar sacarosa.
         2. Use un pequeño LED para indicar el momento en que el estímulo olor durante cada ensayo. Si es posible utilizar un LED rojo, ya que los fotorreceptores abejas se desplazan lejos de largos [Rojo] longitudes de onda más cortas y hacia [uv] longitudes de onda por lo que no pueden ver bien. Coloque el LED detrás y debajo de la abeja, fuera de su campo visual, por lo que la luz no se convierta en un estímulo condicionado inadvertida.
            NOTA: La light también ayuda a verificar que el PLC está funcionando correctamente y es útil en el análisis de las grabaciones de vídeo de las respuestas de las abejas durante los ensayos de prueba.
      3. El Sistema de escape
         1. Establecer un sistema de escape detrás de la abeja para ayudar a sacar el aire más allá de la abeja y de evacuar el aire cargado de olor de la arena acondicionado para mantener un marco de tiempo discreto para cada presentación del olor.
            NOTA: Si hay un sistema de vacío en el laboratorio, modificar el puerto de vacío y conectar un conducto de tubo secador para proporcionar el flujo de aire necesario para evacuar la arena acondicionado. Si no hay un sistema de vacío, un pequeño ventilador eléctrico alojado en línea con el tubo secador condujo a una campana de ventilación o a través de una ventana será suficiente.
      4. Al comienzo de cada día, revise las conexiones eléctricas y de aire del sistema de entrega de olor y el sistema de escape. Pulse el botón de inicio en el sistema de entrega de olores y controlar el tiempo entre la pulsación delbotón y cuando las válvulas abiertas (un clic tranquila y la luz LED se enciende) y cuando la señal para presentar el estímulo no condicionado (un tono audible) sonidos. Compruebe el suministro de aire mediante la colocación de la punta del dedo húmedo en frente del conector que se vaya a conectar al cartucho de olor. No debe haber una corriente de aire fuerte sólo cuando las válvulas están abiertas. Revise el sistema de escape mediante la celebración de un pañuelo de papel hasta que no suelte pelusa para la apertura del sistema de escape para asegurarse de que el flujo de aire es lo suficientemente fuerte como para evacuar correctamente el aire acondicionado de la arena.
   3. Montaje del cartucho de Olor
      1. Coloque un poco de pasta de modelar, ya sea en el mostrador o en una pequeña plexiglás pie para colocar el cartucho de abeja y olor directamente en frente del sistema de escape. Coloque la jeringa olor de vidrio en la arcilla y ajustarlo de modo que la abertura en el extremo ancho está apuntando a la cabeza de la abeja. El extremo de la jeringa debe ser de 1-2 cm de la abeja. Escoja una distancia dentro de este rango y ser constante.
      2. Colocar firmemente el accesorio de conectar el cartucho al tubo de aire y sistema de válvula en el extremo estrecho de vidrio esmerilado de la jeringa.
   4. La presentación de los Estímulo de olor
      1. Al comienzo de cada ensayo, colocar la abeja aprovechado en la clavija en la arena acondicionado con sus antenas apuntan directamente hacia el cartucho de olor. Que el resto de abeja en la arena de 15-25 segundos antes de comenzar el estímulo de olor para permitir que se acostumbre a su nuevo entorno.
         NOTA: Si la abeja comienza a responder al cartucho olor inmediatamente después de ser colocado en la arena acondicionado, puede haber olor en la punta del cartucho. Quitar el olor contamine lavando el cartucho con un paño sin pelusa humedecido en etanol al 70%. Si eso no resuelve el problema, sustituya el cartucho.
      2. Pulse el botón de arranque para iniciar el mecanismo de tiempo para la entrega de olores. Monitorear la respuesta de la abeja para el olor después de estímuloinicio y antes de la presentación del estímulo incondicionado.
      3. Después de cada ensayo, permita que la abeja para descansar en la arena acondicionado para otro 15-25 segundos para permitir la formación de la memoria inicial. Mover la abeja demasiado pronto después del juicio reducirá significativamente la eficacia de cada ensayo de condicionamiento.
4. La entrega de la sacarosa (incondicionado Estímulo)
   1. Método 1
      1. Para este método, utilizar un palillo para entregar la sacarosa.
         NOTA: Es mejor usar un palillo de dientes de plástico ya que los palillos de madera pueden tener un olor que influirá en las respuestas de las abejas para el estímulo condicionado.
      2. Sumerja la punta del palillo en la solución de sacarosa, y, cuando llega el momento de presentar el estímulo incondicionado, mantenga el palillo de dientes en la parte frontal de la abeja y permite la abeja a lamer la sacarosa del palillo de dientes por 1 segundo aprox.
      3. Vuelva a colocar el palillo de dientes con regularidad para evitar la acumulación de doCrose.
   2. Método 2
      1. Sistema de Entrega de sacarosa
         NOTA: Una forma más precisa para entregar el estímulo incondicionado es a través del uso de jeringas micrómetro, que pueden entregar con precisión cantidades pequeñas (décimas de microlitro) de la sacarosa recompensa.
         1. Enrollar el micrómetro de la jeringa hacia atrás tanto como sea posible. Cargar el barril de la jeringa micrométrica con la solución de sacarosa. Asegúrese de que no haya burbujas en la parte de vidrio y montar la jeringa. Llenar el cubo de la aguja con la solución de sacarosa antes de colocarlo en el extremo estrecho del cuerpo de la jeringa. Para asegurarse de que el fluido en la aguja es en realidad sacarosa y no agua de lavado de la aguja, enrollar el micrómetro hacia adelante 1-2 l antes de comenzar el experimento.
   3. Presentación de sacarosa
      1. Mantenga la punta de la aguja aproximadamente 2 cm de la abeja mientras que el olor se presenta. Utilice el borde de la arena de entrenamiento para preveniragitando la jeringa como el movimiento puede distraer la abeja. No permita que la aguja demasiado cerca a la espera de la señal de alimentación, ya que también se desplazará prematuramente la atención de la abeja del olor a la sacarosa.
      2. Tan pronto como suene la señal de alimentación, toque ligeramente las antenas hasta que la abeja se extiende su probóscide, luego alimentar a la abeja. Esto debería requerir sólo un toque muy ligero o dos para las antenas.
         1. Use una cantidad de recompensa entre 0,2 y 0,8 l. La abeja debe consumir fácilmente toda la gota dentro del período de tiempo asignado para el estímulo incondicionado (~ 2.1 seg). No utilice "ad libitum" de alimentación de una gran gota, que la abeja se alimenta de varios segundos, pero no puede consumir por completo.
         2. Ver sacarosa para acumularse en la antena, lo que reducirá la respuesta de la abeja para presentaciones posteriores de la recompensa. Modificar el procedimiento de alimentación si esto ocurre.
         3. Para asegurar el emparejamiento exacto del olorcue y la recompensa sacarosa, asegúrese de presentar la gota de solución de sacarosa a la abeja tan pronto como sea posible después del tono.
            NOTA: El tiempo entre el inicio de la CS (olor) y US (sacarosa) es crítica. Idealmente, la presentación de olor y presentación de sacarosa deben superponerse brevemente. Si hay más de unos pocos segundos entre la final de la CS y la entrega de los EE.UU., el rendimiento disminuirá acondicionado.

4. Testing

1. Siguiendo uso acondicionado ensayos de prueba no reforzados para evaluar qué tan bien aprendidas las abejas y / o recordar la asociación acondicionado.
   NOTA: Véase la discusión para una explicación detallada de la importancia de analizar las respuestas de los ensayos de prueba no reforzados, además de las abejas las abejas el rendimiento en los ensayos de condicionamiento y una explicación del propósito de la serie de ensayos de prueba y los olores de la prueba.
2. Tiempo de consolidación
   1. Siguiendoacondicionado, ya sea administrar un ensayo de prueba inmediata o permiten las abejas para descansar por un período de consolidación.
      NOTA: La longitud del período de consolidación, el intervalo de tiempo entre acondicionamiento y ensayo, dependerá del objetivo del experimento. Si el propósito es investigar las diferencias de aprendizaje o memoria a corto plazo, el rendimiento de las abejas en los ensayos de prueba se puede evaluar inmediatamente después o varias horas después del acondicionamiento. Si el experimento consiste en la investigación de la memoria a largo plazo, los ensayos de prueba se debe dar por lo menos 24 horas después de la final de acondicionado.
   2. Si los ensayos de prueba son más de 24 horas después del acondicionamiento, alimentar a las abejas hasta la saciedad con 0,5 M de sacarosa siguiente acondicionado y por lo menos una vez al día después hasta 12-24 horas antes de los ensayos de prueba.
      1. Para asegurarse de que las abejas han alcanzado la saciedad, alimentar a cada uno de ellos en varias ocasiones diferentes hasta que ya no extienden su probóscide en respuesta a tocarse la antenaE con sacarosa. Pueden consumir hasta 40 l para llegar a la saciedad.
   3. Mantenga las abejas en un recipiente humidificado para evitar su desecación y morir durante el período de consolidación.
3. ENSAYOS
   1. Utilice cartuchos de olor sólo recién preparados para la prueba.
      NOTA: Los cartuchos utilizados para la adquisición puede ser diferencialmente agota, por lo que el estímulo de prueba no será constante durante los ensayos, olores, y las abejas individuales y, por lo tanto, podría afectar significativamente la consistencia y la solidez de los resultados.
   2. Durante la prueba, mantener el mismo intervalo entre ensayos y otros parámetros como se utiliza en la fase de acondicionamiento del experimento.
   3. No presentar el estímulo no condicionado durante los ensayos de prueba, ya que la presencia de una recompensa alterará la respuesta de las abejas para el estímulo condicionado, lo que podría enmascarar efectos más sutiles del protocolo acondicionado o un tratamiento.
   4. Grabar videos de todo of los ensayos de prueba para poder medir posteriormente múltiples aspectos respuestas de las abejas al olor (s).

5. Grabación de respuestas de las abejas

1. Binaria (presencia / ausencia) de puntuación de PER
   1. Utilice un sistema de puntuación binaria del PER durante ensayos de condicionamiento y durante los ensayos de prueba. Puntuación respuestas como positivo o negativo; esto es satisfactoria para muchos tipos de análisis con un tamaño de muestra de 20 a 40 abejas por grupo de tratamiento. La topología exacta de las respuestas puede ser complejo ^22. Es importante establecer una forma fácil de ver y anotar criterio para una respuesta positiva.
      1. Puntuación respuesta de una abeja como positivo (+) cuando la abeja se extiende su trompa más allá de la línea hecha mediante la conexión de las puntas de las mandíbulas abiertas. Sólo anotar una respuesta positiva cuando la abeja se extiende su trompa después de la aparición de olores pero antes de compensar olor.
      2. Puntuación respuesta de una abeja como negativo (-) cuando no hay correoxtension de la probóscide durante el juicio o si la trompa se amplía después de que el desplazamiento del odorante.
      3. Evite tratar de anotar las respuestas parciales. Para hacer distinciones más sutiles en el comportamiento de las abejas, utilice la técnica de análisis de vídeo se describe a continuación.
2. Análisis de vídeo de PER adicionales Medidas (Película 1)
   1. Reunir información adicional de pruebas de comportamiento mediante el análisis de los vídeos de las respuestas de una abeja a un olor.
      NOTA: Estas medidas también pueden proporcionar una mayor resolución temporal para el examen de las respuestas de las abejas a los olores, sobre todo cuando no hay una diferencia en el marcador de presencia / ausencia de PER entre los grupos de tratamiento.
   2. Grabación de los vídeos
      1. Utilice siempre ensayos de prueba o de extinción no reforzados para grabaciones de vídeo. La presencia de la recompensa va a alterar la respuesta de las abejas al olor, la modificación de la duración de la extensión de la probóscide.
      2. Establezca una cámara de vídeo en un trípode sobre el campo de la formación y enfocar la cámara en la parte frontal de la cabeza de la abeja, por lo que las antenas y la probóscide están en foco agudo.
      3. Coloque la pequeña luz LED, que indica olor presentación del estímulo, en un área detrás de la abeja que es visible en el vídeo con el fin de utilizarla para identificar la aparición de olores y el desplazamiento durante el análisis.
      4. Comenzar a grabar 20 seg antes de la aparición de olores y continuar la grabación durante al menos 20 segundos después de olor compensado antes de alterar la abeja.
   3. Análisis de vídeo
      1. Sube los vídeos en el software de edición de vídeo, como iMovie o Final Cut Pro, con la capacidad de medir intervalos de tiempo entre los fotogramas específicos en el video.
      2. Analizar la respuesta de las abejas al olor durante un período de tiempo discreto a partir de la aparición del olor estímulo (por ejemplo, 10 o 20 seg).
      3. Utilice las siguientes mediciones comunes para la evaluación de PER:
         1. Mida laduración de la trompa de extensión, que es el tiempo total que la trompa se extiende más allá de la línea de la mandíbula a mandíbula (descrito anteriormente).
            NOTA: Una abeja puede extender y retraer su probóscide varias veces durante la ventana de tiempo de 10 a 20 seg. Mida cada extensión probóscide individualmente, y calcular la duración total. Analizando el número y la duración de cada prórroga probóscide individuo también puede proporcionar información valiosa.
         2. Medir la latencia de extensión probóscide, que es el tiempo entre la aparición de olores, cuando la luz LED se enciende, y la primera extensión probóscide.
         3. Contar y extensiones de tiempo glossal relativos a la aparición de olor, la primera extensión, u otros parámetros de sincronización.
         4. Seguimiento de movimientos antenales ^23, que muestran también los cambios de olor orientada característicos.
            NOTA: En la película 1, los movimientos de las antenas han sido rastreados con software de seguimiento de vídeo para ilustrar el cambio en los movimientos de las antenas in respuesta a un estímulo de olor.

Resultados

Se presentan dos ejemplos de uso de los protocolos POR descritos anteriormente. El primer ejemplo de uso que se haga Método 2 para estudiar cómo las abejas perciben diferentes olores como una función de la similitud molecular al olor utilizado como el CS ^5,24,25. El segundo es un ejemplo del uso del método 1 y algunas de las precauciones que deben tomarse al comenzar a utilizar PER experimentos de condicionamiento en el laboratorio de investigación.

Estudios como éste se han utilizado para describir el "espacio perceptual 'olfativo de las abejas y polillas en conjunto con Bioimagen ¹³ o electrofisiológico análisis ^26. Las abejas de miel (n = 20) fueron condicionados para asociar el odorante decanal con refuerzo de sacarosa en 12 hacia adelante emparejamiento ensayos de condicionamiento (Figura 3A). Aproximadamente el 10% de las abejas de la miel respondió "espontáneamente" en el primer juicio, que es normal. Después de que el porcentaje que Responded aumentará en los próximos ensayos hasta el 100% de las abejas de la miel respondió en el quinto ensayo y cada juicio posterior. Varios estudios han demostrado que este aumento de la respuesta es específica a la condición de emparejamiento hacia adelante (Figura 1) con relación a varios procedimientos de control importantes ^3. Después de la fase de adquisición, cada abeja de la miel fue sometido a una serie de ensayos de prueba no reforzadas (Figura 3B), que implicó la exposición al olor CS y para varias otras sustancias olorosas que sistemáticamente diferían de la CS en las estructuras moleculares. Las abejas de miel respondieron más fuertemente a la CS. Sus respuestas a los otros olores disminuyeron en función de los cambios sistemáticos en la estructura, con las respuestas más bajas a los odorantes menos igual que el CS.

En la Figura 4, los resultados de un reciente taller en el que los estudiantes aprendieron, por primera vez, cómo condicionan las abejas que utilizan el método 1 se ilustran. Estudiantes abetos t condicionada abejas por methycyclohexanone adelante emparejamiento (MCH) o octanol (OCT) con refuerzo de sacarosa (Figura 4A). Porcentaje respuestas fueron más bajos en el primer juicio y se incrementaron en ensayos posteriores, lo que indica que las abejas aprendieron la asociación de olores sacarosa. Hubo diferencias en el grado en que las abejas aprendieron la asociación entre los diferentes grupos de estudiantes condicionado. En nuestra experiencia, este tipo de diferencias podrían deberse a que el olor que se usó como el CS, a los elementos imprecisos en el método (Método 1), o con el nivel de formación de los experimentadores. En el tercer caso, el rendimiento se vuelve rápidamente más consistente con el aumento de la experiencia de los experimentadores. Después del acondicionamiento, cada abeja de la miel se probó dos veces con cada olor. En grupos de abejas que se había acondicionado con maridaje delantero de octubre o MCH, la respuesta fue, como se esperaba, más fuerte que el olor acondicionado (Figura 4B).

ent "> El segundo grupo de abejas de la miel que experimentaron adelante emparejamiento de octubre se acondicionó en paralelo a otro grupo en el que el olor octubre fue hacia atrás emparejado con sacarosa. maridaje con versiones anteriores es uno de los varios tipos de procedimientos de control para demostrar que el aumento de la respuesta es específico para reenviar el emparejamiento y no se debe a otro proceso, como la excitación no específica de sensibilización. Para emparejar hacia atrás, los EE.UU. sacarosa y olor CS se presentan en orden inverso a lo que se muestra en la Figura 1. Adquisición de datos de emparejamiento hacia atrás somos no se muestra porque la CR no se puede marcar da la presentación del olor CS después de la presentación de la sacarosa. como se predijo para el acondicionamiento asociativo, los niveles de respuesta a octubre fueron mayores en el grupo hacia adelante emparejado con respecto al grupo hacia atrás (Figura 4C).

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Figura 1. Diagramas de diseño experimental para el acondicionamiento utilizando adelante emparejamiento. Véase la Tabla 1 para las definiciones de los términos utilizados en esta figura. (A) El CS (olor) precede y se superpone con los EE.UU. (solución / agua sacarosa). La relación entre el CS y los Estados Unidos se muestra es óptima para las abejas de miel acondicionado y polillas. Pero la óptima ISI puede depender del protocolo de condicionamiento y de los animales de especies ^1. (B) Desglose y tiempo relativo de CS, CR, Estados Unidos, y UR. El CR que se produce, ya sea antes de la presentación de Estados Unidos o durante los ensayos no reforzados 'prueba' es la medida depende de los protocolos experimentales.

Figura 2. agotamiento de Olor con reutilización de cartuchos. Para estos datos, los cartuchos de olor eranset-up con hexanol como se describe en el texto. Hexanol se usa comúnmente como un CS en estudios PER; sin embargo, la tasa real de agotamiento dependerá del olor y disolvente. Cartuchos fueron utilizadas una vez durante 4 segundos cada minuto más de 8 ensayos (suponiendo 5 abejas / ensayo en un experimento estándar que sería igual a 40 usos). Las diluciones en el disolvente indicado, que eran relativamente estándar para PER experimentos, fueron de 2,0 M (A) y 0,2 M (B). (A, B) El olor se tomaron muestras después de la primera y la octava ensayos de adsorción sobre una fase sólida microextracción (SPME) de la fibra, que luego se desorbe en un cromatógrafo de gases. Las áreas relativas bajo los picos fueron más altos después de la primera prueba relativa a la octava para ambos disolventes y para ambas concentraciones (pares de Wilcoxon firmado prueba de rango p <0,05 [*] o superior), lo que demuestra que menos olor fue entregado desde el cartucho después de que el cartucho se ha utilizado en varias ocasiones. (C, D) Los mismos datos muestran sólo la octava tr Ial con el eje y ampliado. Se muestra que el agotamiento fue ligeramente mayor en relación con hexano para aceite mineral, sino sólo a la concentración más baja.

Figura 3. Adquisición y prueba utilizando decanal como el CS y el método 2 al condicionamiento. (A) de prueba por prueba de respuesta (CR) de más de 12 ensayos de apareamiento hacia adelante (Figura 1). Los datos proceden de las abejas n = 20 miel acondicionado en cuatro grupos de 5 abejas cada una. El ISI fue de 3 segundos y el ITI era 6 min. (B) utilizando pruebas no reforzadas olores que difieren de decanal por la longitud y / o la posición del carbono del carbonilo de la cadena de carbono. Los olores se presentaron en una serie aleatorio a través de los cuatro grupos y se intercalan con los ensayos reforzados con decanal (cada dos o tres ensayos) con el fin de evitar la extinción de la CR.

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Figura 4. Los datos de un taller en el que se gradúan los estudiantes fueron entrenados para condicionar las abejas utilizando PER método 1. datos (A) Adquisición de tres grupos de abejas condicionadas a octanol (n = 23 y 15 para Gps 1 y 2, respectivamente) y metilciclohexanona (n = 10) (B) durante las pruebas de CRs no reforzadas con ambos olores.; cuatro ensayos presentados en la serie al azar entre los grupos. (C) las pruebas no reforzadas con dos olores en dos grupos de abejas de la miel, uno hacia adelante emparejado (Gp 1, n = 23) y uno hacia atrás emparejados (n = 25).

Término (abreviatura)	Definición	Ejemplo relevante
Estímulo condicionado (CS)	Aestímulo que provoca poca o ninguna respuesta al primero y las señales de los Estados Unidos	OLOR
Respuesta condicionada (RC) un	La respuesta a la CS después de la asociación con los EE.UU.	PROBÓSCIDE EXTENSION
Estímulo incondicionado (EI)	Un estímulo biológicamente significativo que provoca una respuesta	SACAROSA / SOLUCIÓN DE AGUA
Respuesta incondicionada (RI) un	La respuesta a los EE.UU.	PROBÓSCIDE EXTENSION
Inter-estímulo Intervalo (ISI)	El tiempo entre el inicio de la CS y la aparición de los EE.UU.	OLOR al intervalo SACAROSA
Inter-Trial Intervalo (ITI)	El tiempo entre los sucesivos emparejamientos CS-Estados Unidos para un solo animal	OLOR (ensayo n) a OLOR (ensayo n + 1) intervalo

Tabla 1. Importante Terminología. Consulte la Figura 1 para una ilustración de estos términos. ^un PER acondicionado Para el CR y UR son los mismos, aunque para otros tipos de asociaciones y reflejos del CR y UR pueden ser diferentes.

Película 1. Un video de una abeja realizar PER después de que había sido condicionado para responder a un olor. Tenga en cuenta la respuesta de PER de la abeja alrededor de 1,5 seg después de la aparición de olores. Software de seguimiento de mapeado los movimientos de las antenas en respuesta a la presentación del olor. Las líneas trazadas en la esquina superior derecha del vídeo muestran los movimientos de las antenas reales. Los dos gráficos en la parte inferior de la pantalla muestran los movimientos de las antenas en la X (izquierda) e Y (derecha) coordina. Las líneas verticales en el gráfico que se muestra en el video indican, de izquierda a derecha, la luz ON, PER, luz apagada y probóscide retracción.

Discusión

Este protocolo presenta dos métodos fiables para el acondicionamiento mediante el procedimiento de PER. Estos son dos de los varios métodos que se han empleado con éxito ^{27, 21.} Empleamos el método 2 para todos los estudios experimentales utilizando PER, ya que es siempre fiable, incluso a través de diferentes experimentadores.

El mismo procedimiento básico se ha adaptado a muchos tipos diferentes de estudios con abejas de la miel, como el uso de diferentes estímulos y condicionantes diferentes reflejos conductuales. También se ha relacionado a las investigaciones de la base genética de las diferencias en el aprendizaje de ^28,29, las correlaciones fisiológicas de la percepción olfativa y la memoria en el cerebro ^13,14,30, y los moduladores y moleculares bases genéticas de la conducta ^15,16,31 . Debido a la avanzada del conocimiento de la relevancia ecológica de aprendizaje olfativo para las abejas de miel, que comenzó con los primeros estudios realizados por Karl von Frisch hace más de 100 años ^{31, los resultados de PER puede ser fácilmente vinculado a las necesidades de supervivencia de una colonia. Más recientemente, se ha adaptado a un estudio agrícola para investigar los efectos de comportamiento subletales de pesticidas y toxinas del medio ambiente 17.}

El procedimiento básico es de gran alcance en el que se puede aplicar a investigar los problemas en otras especies también. Dos especies de polillas, Manduca sexta y Spodoptera littoralis, se han utilizado en estudios de POR para investigar la base neural de la identificación del olor y las capacidades de aprendizaje olfativo de cada especie ^32,33. POR experimentos con moscas de la fruta han proporcionado muchos conocimientos sobre las cascadas de señalización moleculares implicados en chemosensation y el aprendizaje ^34. Y POR recientemente se ha utilizado para estudiar la habituación en la pulga (Rhodnius prolixus) ^35, un vector de la enfermedad importante.

En general, el procedimiento es robusto a cambios en el método; el uso de dmétodos ifferent probablemente producirán la misma diferencia relativa entre los grupos de tratamiento. A pesar del procedimiento relativamente simple, varios problemas a veces puede evitar que las abejas de miel de aprendizaje de la asociación de olores sacarosa. Los temas siguientes son las posibles adaptaciones del protocolo y algunos de los problemas más comunes que pueden surgir durante PER acondicionado.

Consideraciones sobre el número y tipo de ensayos en el Protocolo acondicionado

Cualquier protocolo de aprendizaje requerirá la exposición de las abejas a una serie de ensayos en la fase de adquisición. Este número depende en gran medida de la dificultad de la tarea. Las abejas pueden aprender una tarea sencilla después de un único ensayo, pero necesitan al menos unos tres ensayos para inducir la formación de la memoria a largo plazo. Como era de esperar, las abejas de la miel requerirán significativamente más ensayos para aprender adecuadamente una tarea difícil. Generalmente, hay un número máximo de ensayos más allá del cual las abejas ya no mejoran significativamente larendimiento IR. Este máximo depende de la tarea específica, los tipos de olores y concentraciones, y la concentración de sacarosa.

Cuando se utiliza más de un tipo de ensayo con diferentes olores, presentar los diferentes tipos de ensayos en una secuencia pseudoaleatoria para mantener las abejas a partir de la memorización de una simple secuencia de presentaciones de olores en lugar de aprender las diferencias entre los olores ^36. En estas secuencias pseudoaleatorias, debe haber un número igual de los ensayos para cada uno de los tipos de olores. Además, la probabilidad de un ensayo de un tipo de olor está precedida por y seguido por el mismo olor, o cualquiera de los otros olores, debe ser igual para todos los olores. Durante dos olores - A y B - utilizar la siguiente secuencia: ABBABAAB. Más de ocho ensayos cada olor se presenta cuatro veces. Concatenar secuencias idénticas para alcanzar el número deseado de ensayos para cada olor.

Independientemente del diseño experimental, hay algunos parámetros que deben permanecerconstante con el fin de optimizar el aprendizaje. La coincidencia entre el CS y los EE.UU. es fundamental para el acondicionamiento eficaz. El intervalo entre ensayos (Figura 1, Tabla 1) tiene que ser constante y estar optimizado debido a irregularidades o el intervalo entre ensayos demasiado corto o demasiado largo, pueden influir significativamente en la eficacia del protocolo acondicionado ^1.

Consideraciones sobre la importancia y el diseño de los ensayos de pruebas de comportamiento

Las respuestas registradas durante la 'fase de adquisición' de un experimento, cuando el EC y el EI se presentan juntos, pueden ser útiles. Sin embargo, ten en cuenta que las condiciones de presentación de olores pueden variar de un tipo de ensayo a otro. Durante los ensayos reforzados, el olor seguido de sacarosa se presenta en relación con un estímulo visual (movimiento del dispositivo para la entrega de la gotita de sacarosa) que puede afectar a la respuesta de la abeja. Y las abejas tienen sólo tres segundoss para mostrar una respuesta (cuatro segundos de estimulación olor menos el solapamiento con uno sec presentación sacarosa; Figura 1). Si el experimento implica las abejas de aprendizaje para diferenciar dos olores (por ejemplo, reforzado y no reforzado), el olor no reforzado presentado en ensayos alternativos se produce sin el estímulo visual de la presentación recompensa y las abejas tienen los total de cuatro segundos para responder. Por lo tanto, las respuestas a los dos olores no son totalmente comparables durante la adquisición. Con cualquier protocolo acondicionado, no se basan exclusivamente en las curvas de adquisición ^1. Para conocer mejor lo que las abejas han aprendido, introducir una serie de ensayos de prueba sin refuerzo, durante el cual se refuerza ni olor, lo que asegura que las pruebas de todos los estímulos tiene lugar bajo condiciones idénticas.

Dependiendo de la finalidad específica del experimento, la prueba puede consistir en ensayos de prueba individuales del olor acondicionado o una serie de ensayos con el OD acondicionadoo o una combinación de los olores acondicionado y novedosos. Un único ensayo de prueba del olor acondicionado ofrece un sencillo ensayo de si las abejas recuerdan el olor acondicionado. Sin embargo, la respuesta a la primera prueba de ensayo puede reflejar el nivel de motivación de las abejas, así como su recuerdo del olor acondicionado. Una serie de ensayos de prueba, ya sea de una serie de ensayos de extinción del olor acondicionado o una serie de pruebas individuales de lo condicionado y uno o más nuevos olores, también se puede utilizar para evaluar la memoria. La serie de ensayos de extinción puede evaluar la fuerza con las abejas recuerdan la asociación acondicionado. Cuanto más fuerte es el retiro del mercado del mayor número de ensayos necesarios para extinguir la respuesta condicionada. Una serie de pruebas individuales de olores condicionados y novedosas también puede evaluar la especificidad de memoria del olor acondicionado de las abejas.

También es imprescindible para acondicionar y poner a prueba tanto el control y los grupos tratados en los mismos momentos. Comparción del rendimiento de las abejas pronto después del acondicionamiento a las abejas mantenidas por períodos de tiempo más largos es problemático debido a la exposición a los EE.UU. sacarosa al alimentar a las abejas hasta la saciedad. Por ejemplo, una disminución en el rendimiento después de largos intervalos podría ser debido a la desintegración de memoria o podría ser debido a cambios en el estado de motivación y / o de aprendizaje inducidos por la exposición no reforzada a los EE.UU., haciendo que los resultados ambiguos. Por lo tanto, el rendimiento de un grupo de tratamiento siempre debe ser juzgada en relación con un grupo de control acondicionado y probado en los mismos puntos de tiempo.

Concentración de olor e Integridad

Hay varias formas en las que la concentración y la integridad del olor (CS) puede ser comprometida. El problema más frecuente con la entrega de olor es el agotamiento de los cartuchos de olor por el uso excesivo (Figura 2). Vuelva a colocar los cartuchos de 10-12 usos (cada 2 o 3 ensayos con grupos de 5 abejas) para evitar este escollo. También es importante utilizarcartuchos frescos para ensayos de prueba, ya que los cartuchos usados ​​pueden ser agotados diferencialmente y por lo tanto presentan desiguales estímulos de olor. Otro problema común es la contaminación cartucho de olor debido al uso del cartucho para más de un olor sin limpiar completamente. Un flujo de aire sucio o contaminado puede también introducir involuntariamente estímulo olfativo adicional (filtros de carbón activo pueden prevenir la contaminación de fondo). Esto es especialmente problemático cuando el acoplamiento de acuerdo acondicionado con las mediciones de las respuestas fisiológicas al olor. Cartuchos de olor con fugas presentan un problema puesto que las abejas melíferas están expuestos al olor antes de que comience el ensayo, lo que reduce la saliencia del estímulo de olor. Suelta en el suministro de aire para la entrega olor puede resultar en poca o ninguna entrega olor cuando se abre la válvula, reduciendo artificialmente la respuesta de las abejas al olor previsto.

Solución de sucrosa y estímulo incondicionado (recompensa)

El unmontaje, la concentración, y la integridad de la solución de sacarosa utilizado como los EE.UU. son vitales para el éxito del experimento. Acondicionado es una función de la cantidad y concentración de la solución de sacarosa-agua usado como los EE.UU. ^37. Las jeringas micrómetro utilizados en el método 2 permite un control muy preciso (hasta 0,2 l) de la prestación de los Estados Unidos, y recomendamos su uso para ambos métodos. El uso de los palillos de dientes (Método 1) es adecuada para las circunstancias en las que las jeringas caros no se pueden utilizar, como, en la formación de grandes grupos de estudiantes, el trabajo en el campo, o con presupuestos más bajos. Aplicación cuidadosa del método 1 es bien siempre y cuando el tiempo se mantiene con el reemplazo regular de palillos de dientes para evitar la acumulación de sacarosa (y la concentración administrada). Sin embargo, usando palillos de dientes es más difícil de controlar con precisión y calcular la cantidad y la magnitud de los EE.UU. entregado, que es importante para los estudios de acondicionamiento ^1. La concentración de sacarosa necesaria paraproporcionar una recompensa suficiente para mantener a las abejas motivados para aprender la asociación acondicionado puede depender de la dificultad de la tarea y el estado interno de las abejas o época del año. Las tareas más difíciles requieren una solución de sacarosa más alto para las abejas para aprender con éxito la tarea. El moho puede acumular en soluciones de sacarosa incluso a 5 ° C, lo que pondrá en peligro la integridad de la solución, lo que afecta la salud y la percepción de la recompensa de las abejas durante el experimento. Es mejor reemplazar la solución cada pocos días.

Precisión, oportunidad y consistencia de EC y Entrega

El problema más crítico sobre la correcta aplicación de un procedimiento de PER, o para el caso cualquier procedimiento de acondicionamiento, implica precisión, oportunidad y coherencia de CS y la entrega de Estados Unidos (Figura 1). Los investigadores que son nuevos en el procedimiento con frecuencia son imprecisos acerca de la entrega de uno o ambos estímulos. ISIque no permitan que la superposición de la EC y resultar en un rendimiento acondicionado. El PLC automatiza una señal audible para el experimentador para entregar sacarosa 3 segundos después del inicio de la entrega olor. Los investigadores deben mantener la sacarosa / gota de agua cerca de la abeja para la entrega rápida después de la señal. Estos procedimientos ayudan a arrastrar un ISI consistente. La colocación de un cronómetro por la arena acondicionado permite una conveniente ubicación momento del juicio, así como el seguimiento de tiempo de las abejas en la arena antes y después de la entrega de estímulos. De esa manera los de ITI puede ser relativamente constante y todo el procedimiento se puede correr a un ritmo controlado. De ITI que son demasiado cortos, por ejemplo menos de 1 min, o por mucho tiempo puede conducir a malos resultados acondicionado ^1.

Efectos estacionales, ambientales y contextuales en la miel de abeja Performance

Rendimiento de miel de abeja puede ser influenciado significativamente por su entornotanto antes como durante el acondicionamiento. Con frecuencia, las fluctuaciones en la temperatura y la disponibilidad de alimentos que vienen con el cambio de estaciones alterarán la motivación de las abejas para aprender. Cuando las flores están en flor, la motivación de las abejas para aprender la asociación en el laboratorio acondicionado disminuye ^38. Cuando se insistió en la colonia - de las temperaturas extremas, escasez de alimentos, o el estrés relacionado con la enfermedad - de las abejas mostrarán una reducción de su capacidad de aprendizaje en el interior. Las abejas de miel mantienen en un cuarto vuelo puede aprender bien por un tiempo, pero allí también el estrés de la enfermedad y el envejecimiento degradan su rendimiento de aprendizaje a través del tiempo. El contexto durante el acondicionamiento también puede disminuir el rendimiento de las abejas. Cualquier olores extraños, el movimiento, y otros estímulos pueden distraer la abeja de los estímulos experimentales. Para evitar este problema, mantener un contexto visual razonablemente coherente, simplificado.

Genotipo y Experiencia Afecta POR Performance

trabajadores de abejas pueden diferir considerablemente en el rendimiento en cualquier procedimiento de acondicionamiento debido a la especialización de tareas, genotipo, u otros factores ambientales ^20. Por lo tanto, es importante para estandarizar, tanto como sea posible, los tipos de animales utilizados en un experimento con el fin de reducir la variación inter-individual. En una colonia dirigida por una reina-acoplado abierto, lo que significa que se aparearon con muchos zánganos diferentes, los trabajadores serán diferentes en el genotipo paterno. Antecedentes genéticos puede dar lugar a grandes diferencias en la capacidad de respuesta sensorial ³⁹ y los resultados del aprendizaje ^29. Con colonias encabezadas por reinas inseminadas instrumentalmente por el esperma de los zánganos individuales ²⁸ reduce esta variación interindividual.

Los protocolos descritos anteriormente, incluye un método para recopilar los trabajadores de abejas de la entrada del nido. Sin embargo, estas abejas difieren entre sí en lo que respecta a la edad o la tarea de comportamiento. Pueden ser jóvenes (inexperienced) o mayores () recolectores más experimentados. Pueden ser jóvenes abejas que hacen sus primeros vuelos de orientación. O pueden ser abejas guardianas. Para reducir la variabilidad, marque las abejas con una pintura de esmalte de secado rápido o etiquetas de marcado, ya sea como emergen como adultos (para controlar para la edad) y / o cuando empiezan forrajeo (para el control de la experiencia). Luego, unos días después, recoger las abejas marcadas para el acondicionamiento. Los trabajadores que se dedican a la conducta de enfermería se pueden recoger de los marcos dentro de la colmena. Las enfermeras pueden ser identificados positivamente cuando se meten con sus cabezas en una celda de cría para alimentar y cuidar a la larva en el interior.

Usando Virgen Queens o Drones para PER acondicionado

Además de las abejas obreras, reinas y zánganos de abejas vírgenes se pueden acondicionar fácilmente en un procedimiento PER a estudios destinados a desarrollar las líneas genéticas de abejas de la miel que se diferencian en los resultados del aprendizaje ^28. Reinas vírgenes deben recogerse poco después ªey emergen de la fase de pupa y se coloca directamente en los arneses de sujeción y sin anestesia. Drones jóvenes, inmaduros obtenidos de los panales de cría dentro de la colonia en general, no están motivados para aprender. Después de que hayan comenzado el apareamiento vuelos, drones aprenden fácilmente POR tareas ^28. Deben ser recogidos, ya que volver a partir de un vuelo de apareamiento y se mantienen durante la noche en una pequeña jaula en una colonia utilizadas para la cría reinas. No intente aprovechar el día anterior acondicionado; no sobreviven bien en arneses durante la noche. Un par de horas antes del acondicionamiento de los aviones no tripulados pueden ser recogidos de las jaulas y se colocan en los arneses de sujeción y sin anestesia.

Conclusiones

Este procedimiento PER, en el camino de métodos, asciende a un punto de partida para el diseño de experimentos POR. La mayoría de los protocolos POR requerirán que el procedimiento esbozado ser cambiado de alguna manera de poner en práctica los objetivos específicos del experimento y accommodate los grupos de tratamiento múltiples. Es fácil de implementar. Sin embargo, la aplicación adecuada requiere la atención al detalle y la práctica. Una vez dominado, puede ser un procedimiento de gran alcance para agregar una herramienta de investigación para varios programas de investigación básica y aplicada con diferentes especies de insectos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
Compuestos odoríferos (por ejemplo)
1-hexanol	Sigma-Aldrich	471402-100ML	Para más ejemplos
2-octanona	Sigma-Aldrich	W280208-800G-K	de odorantes, véase cualquiera de
heptanol	Sigma-Aldrich	51778-5ML	los artículos sobre olfato
geraniol	Sigma-Aldrich	163333-25G	procesamiento desde el
nonanal	Sigma-Aldrich	131210-100ML	Laboratorio Smith
Hexano	Sigma-Aldrich	296090-1L
Aceite mineral pesado	Sigma-Aldrich	330760-1L	Asegúrese de que’sin olor.
Etanol	Sigma-Aldrich	459836-1L
Viales de centelleo	Sigma-Aldrich	Z190535-1PAK	Utilice una broca pequeña para perforar un orificio pequeño en la tapa de los viales.
Arnés para abejas			Hecho a medida a partir de pajillas de plástico para refrescos de 0,9 cm de diámetro o tubos de plástico rígido/metal.
Cinta adhesiva
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956-1PAK
Botellas de lavado	Sigma-Aldrich	Z560847-3EA	Para el etanol al 70 %.
Tubo secador
SÓLO PARA EL MÉTODO 1
jeringas plásticas desechables de 20 ml	Cole-Parmer	WU-07945-18
círculos de papel de filtro de 15 mm	Sigma-Aldrich	Z274844-1PAK
Chinchetas
Palillos de dientes
SÓLO PARA EL MÉTODO 2
Jeringa micrométrica Gilmont, 0,2 ml	Cole-Parmer	EW-07840-00
Punta de jeringa micrométrica Gilmont	Cole-Parmer	EW-07841-00
26 G 3/8” Agujas hipodérmicas Leur hub	Fisher Scientific	14-826-10
Jeringas de tuberculina de 1 cc (plástico/vidrio)	Sigma-Aldrich	Z181641-1EA o Z192090-200EA	Existen jeringas de tuberculina de vidrio, pero las jeringas de plástico son mucho menos costosas y funcionarán bien para un número limitado de usos.
Pequeños restrictores de goma/silicona	Cole-Parmer	EW-95702-02	Hecho de tubo de silicona con diámetro exterior de 4,8 mm o de las puntas de goma de los émbolos de jeringas de 1 cc.
[cabecera]
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
papel de filtro de 75 x 100 mm	Sigma-Aldrich	Z695106-500EA
Controlador Lógico Programable Direct Logic 05	Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm, 4 mm, &y tubo de PVC o silicona de 6 mm de diámetro interno	Cole-Parmer	Varios	Cole-Parmer dispone de una amplia selección de tubos adecuados.
Conectores de polipropileno & sus accesorios	Cole-Parmer	Varios	Cole-Parmer ofrece una amplia selección de conectores y accesorios para muchos tamaños de tubos.
Flujoímetro correlacionado de 65 mm	Cole-Parmer	EW-03216-08	Aluminio con flotador de vidrio; para líquidos y gases, con válvula.
O
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Bomba de aire para acuario	Aquacave	AE-TETRA-300
Válvulas solenoide serie LIF para .042 " Tubo ID, Configuración "E"	The Lee Company	LFAA1200118H	Neopreno, 430 SS, 302 SS, 280 mW
Zumbador piezoeléctrico de 12 VCC, 70 dB, con placa de circuito	RadioShack	273-074