Intramiocárdica celular de la entrega: Las observaciones en murinos Hearts

Resumen

De suministro de células intramiocárdica en modelos murinos de enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión o infarto de miocardio, es ampliamente utilizado para poner a prueba el potencial terapéutico de diferentes tipos de células en los estudios de regeneración. Por lo tanto, una descripción detallada y una visualización clara de este procedimiento quirúrgico ayudarán a definir los límites y las ventajas de los análisis de células terapéuticas cardiovasculares en pequeños roedores.

Resumen

Estudios previos mostraron que la entrega celular promueve la función cardíaca mejora por la liberación de citoquinas y factores que aumentan la revascularización del tejido cardiaco y la supervivencia celular. Además, otras observaciones revelaron que las células madre específicas, tales como las células madre cardíacas, células madre mesenquimales y cardioesferas tienen la capacidad de integrar dentro del miocardio circundante por diferenciarse en cardiomiocitos, células musculares lisas y células endoteliales.

A continuación, presentamos los materiales y métodos para la entrega fiable células contráctiles en la pared del ventrículo izquierdo de los ratones immunodepleted. Los pasos principales de este procedimiento microquirúrgico implican anestesia y la analgesia de inyección, intubación intratraqueal, incisión para abrir el pecho y exponer el corazón y la entrega de las células por una estéril aguja de calibre 30 y una jeringa de microlitro de precisión.

Procesamiento de tejidos que consiste en la recolección del corazón, embedding, seccionamiento y tinción histológica mostró que la inyección intramiocárdica de células produce un pequeño daño en la zona epicárdica, así como en la pared ventricular. Células no contráctiles fueron retenidos en la pared del miocardio de ratones inmunocomprometidos y fueron rodeados por una capa de tejido fibrótico, probablemente para proteger de la presión cardiaca y la carga mecánica.

Introducción

Varios protocolos de suministro de células se han probado en modelos murinos y de rata de enfermedades cardiovasculares con el fin de traducir la eficiencia, la eficacia y la seguridad de este procedimiento experimental en pacientes humanos. En pequeños corazones de roedores, de suministro de células intramiocárdica es el método más viable de suministro de células ^1,2, mientras que en el corazón de rata ³ anterógrada y retrógrada de infusión intracoronaria de células ⁴ también se puede utilizar. Ambos métodos tienen límites y ventajas. La entrega de la célula a través de la vía intracoronaria tiene ventajas teóricas sobre la inyección intramuscular directa en la promoción de la difusión de células mundial ^3, pero también tiene el riesgo de provocar embolia coronaria ^3,5. Limitaciones en la entrega intramyocardial están asociados con la lesión mecánica, inflamación aguda y ^6,7 daño miocárdico. En los seres humanos, las células para la reparación cardíaca son entregados por inyección intramiocárdica mediante un epicárdica endocárdica o quirúrgicoacercarse o por vía arterial intracoronaria ^8. Inyección de rutas transvasculares es adecuado en pacientes con infarto agudo de miocardio y la reperfusión, pero puede no ser posible en caso de oclusiones totales o mala circulación en los vasos del territorio efectuada ^9. La inyección directa en la pared ventricular por inyección transendocárdica o transepicárdico es técnicamente factible en función del estado de salud del paciente. De hecho, se ha demostrado que esta técnica es segura ^10,11, aunque para inyección transepicárdica es necesaria una cirugía abierta de tórax y para transendocárdico se acerca a un mapeo electrofisiológico para cada paciente es necesario para diferenciar los sitios de viables miocardio isquémico o cicatrices ^9.

Es importante destacar que, en los estudios de terapia celular la elección de la mejor célula para ser trasplantado está aún bajo investigación. Análisis a corto plazo (4 semanas) mostraron que la inyección de células madre cardiacas definidos como cardioesferas 12 o células de población lateral de la médula ósea inducida por la ¹³ recuperación funcional cardiaca en murinos y de rata ^{14 15} modelos de infarto de miocardio por la disminución de tamaño de la cicatriz y la muerte celular. El trasplante alogénico de cardioesferas en un modelo de infarto de miocardio de rata sin inmunosupresión fue encontrado para ser seguro, promovió la regeneración cardiaca, y mejora la función del corazón a través de la estimulación de los mecanismos de reparación endógenos ^15. Lin-/c-kit + adultos células progenitoras en el corazón, se mostró a ser auto-renovación, clonogénico, y multipotentes in vitro e in vivo, y cuando se inyecta en un corazón de rata isquémico reconstituido grandes porciones de la pared del miocardio lesionado ¹⁶ y tenía la capacidad para formar las arterias coronarias conductora y de tamaño intermedio ^17. Estos datos prometedores alimentados en fase I y II de los ensayos clínicos en seres humanos: la inyección de las células madre mesenquimales autólogas y alogénicas (MSC) ^{18, 19} cardioesferas, o células madre cardíacas positivas c-Kit (CSC) 20 en isquémicas corazones humanos cada uno mostró efectos beneficiosos en la función cardiaca en estudios a largo plazo. Sin embargo, la amplia a largo plazo de seguimiento y retrospectivo meta-análisis demostraron que la terapia con células madre ofrece un beneficio significativo para algunos pacientes, pero no en otros, con una serie de resultados impredecibles ^21. Es posible que estas limitaciones se requerir el diseño de protocolos específicos de suministro de células para cada individuo y cada enfermedad.

En modelos de ratón y de rata, los estudios a largo plazo revelaron que la inyección de células no mejoró aún más la función cardíaca (12 meses). De hecho, los injertos de cardiomiocitos madre embrionarias humanas derivadas de células (hESC-CM) fueron en gran medida aisladas del miocardio acogida por una capa de tejido fibrótico ^22,23. Resultados similares se han observado tras el trasplante intramiocárdico de mioblastos esqueléticos en el corazón de ratones infartados ^24. FurthermoRe, la capacidad a largo plazo de las MSC alogénicas para preservar la función en el corazón infartado se ha limitado por la transición de una inmunoprivilegiado a un estado inmunogénica después de la diferenciación ^25.

Teniendo en cuenta los desafíos y las perspectivas señaladas anteriormente, se muestra aquí cómo entregar las células por inyección intramiocárdica en ratones. Observamos que las células sin propiedades contráctiles de cardiomiocitos no están conectados con el miocardio anfitrión y forman una masa cohesiva con una barrera delgada fibrótica. Aunque en algunos casos este resultado puede ser ventajoso, el siguiente análisis puede ser útil para entender cómo el injerto de células puede ser modulada para generar estructuras de miocardio funcionalmente conectados.

Protocolo

Se realizaron todos los estudios con animales de conformidad con las normas internacionales (Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo) y nacional (UK Home Office, Ley 1986) regulaciones. Los procedimientos descritos en este documento son parte de nuestro plan de trabajo bajo licencia autoridades del Reino Unido y no se han llevado a cabo con el propósito de la grabación.

1. Preparación de las células

Este protocolo describe la preparación de una línea celular específica (riñón embrionario humano, células HEK293) con fines de demostración. Protocolos específicos de la célula deben ser empleados para el cultivo y, finalmente, la diferenciación de células madre pluripotentes o adultos en linajes celulares específicos.

1. Se cultivan las células en medio DMEM (glucosa alta, 4.500 mg / L) que contiene piruvato de sodio 1%, glutamina 2 mM, 1% de antibiótico penicilina / estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS). Un 10 cm plato debe estar normalmente divide a 01:03 y los medios de comunicación complementado fresca cada dos días.
2. Tratar las células suavemente con trypsen 1x y resuspender en medio DMEM como se describe en 1:01.
3. Contar las células en una cámara de hemocitómetro y recoger 3 x 10 ⁶ células en un tubo separado.
4. Centrifugar en un rotor de cubeta oscilante a 100 g durante 5 min.
5. Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento de células con tampón de fosfato estéril 2x.
6. Resuspender en PBS 1x a una concentración de 10 ^6/50 ul para la inyección en el ventrículo izquierdo de ratones immunodepleted.

2. Condiciones prequirúrgicas

1. Mantener los ratones immunodepleted (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) con gránulos estériles alimentos y el agua en un aislador de temperatura controlada (22 º C, Tabla 1) antes de cada cirugía.
2. Lleve a cabo la cirugía de los ratones immunodepleted bajo una campana de flujo laminar. Limpie el área de trabajo con un 70% de etanol y autoclave instrumentos quirúrgicos (pinzas y tijeras).
3. Encienda almohadillas térmicas para la cirugía y la recuperación. Los cojines de calefacción son importantespara bloquear la disminución de la temperatura corporal que ocurre durante y después de la cirugía.
4. Coloque una jaula limpia y tratada en autoclave en la plataforma de recuperación de calor.
5. Transportar los ratones en sus jaulas originales del aislador a la sala de cirugía en una bolsa de autoclave estéril.
6. Pesar el ratón y de acuerdo con el peso corporal de inyección por vía subcutánea (sc) una solución que contiene medetomidina y clorhidrato de ketamina diluido en solución salina estéril al 0,9% para anestesiar el ratón, así como para relajar la musculatura (medetomidina 1 mg / kg; clorhidrato de ketamina 75 mg / kg).
7. Retire el ratón de la jaula cuando está completamente anestesiado (a menos de 1-2 minutos, sin reflejo toe-pinch después de la estimulación)
8. Aplicar crema de depilación en el lado izquierdo del pecho y el área de la garganta. Después de una cantidad adecuada de tiempo (aproximadamente 2-5 minutos), limpie los pelos sueltos con un pañuelo de papel humedecido con agua.
9. Coloque el ratón en el panel de la cirugía en posición supina. Desdepunto de vista del cirujano la posición es vertical, la cola hacia abajo la cabeza.
10. Inyectar la solución analgésica a 0,1-0,2 mg / diluida en solución salina estéril (buprenorfina) en la vía subcutánea de las extremidades posteriores g y para abarcar la zona afeitada con la solución de yodo povidona aséptica utilizando un aplicador con punta de algodón.
11. Enfocar el microscopio (objetivo 2,5 veces) en el área de la garganta.

3. Condiciones Quirúrgicos

1. Con unas tijeras romas hacen una incisión en la piel ventral de aproximadamente 0,5-1 cm de longitud ligeramente por debajo del cartílago cricoides. Separar la piel del tejido conectivo para visualizar las glándulas salivales.
2. Dividir las glándulas salivales en su división de línea media natural, tirando al mismo tiempo cada parte lateral con fórceps y magnético retractor pecho y exponer la tráquea.
3. Tirar de la lengua suavemente a un lado para dejar al descubierto la laringe. Deslice el tubo de intubación con cuidado dentro de la tráquea. La punta del tubo es visible a través del l visualizadoarynx y la tráquea. Es importante destacar que, si el tubo está en, pero no claramente visible, que es en el esófago. Retirar y cambiar la posición de la punta del tubo.
4. Conectar el tubo a la máquina de ventilación. Ajuste el volumen de eyección a 200 ly 150 tiempos / min. Asegure el tubo de ventilación en el panel de la cirugía con una cinta.
5. Con tijeras de punta roma y pinzas, hacer una cola vertical a frente 1 - a 1,5 cm de largo incisión en la piel sobre el área del tórax izquierdo.
6. Afloje la piel desde las capas de tejido / conectivos y musculares mayores y menores músculos pectorales sin hacer incisiones.
7. Realizar toracotomía entre las tercera y cuarta costillas de la siguiente manera:
   1. Perfore la capa de músculo intercostal pellizcando y arañando con pinzas pequeñas, redondeadas.
   2. Una vez que la capa de músculo intercostal está perforado, colocar el retractor pecho para abrir al máximo la cavidad torácica. Las partes alta y media del ventrículo izquierdo (VI) con su oreja suprayacente (aurícula) sonahora visible.
8. Preparar una jeringa de precisión con las células. La jeringa debe ser capaz de entregar una cantidad de volumen de 10 ul para cada inyección. Fundido una aguja de 30 G en la punta de la jeringa.
9. Fijar con cinta una pequeña cánula de plástico (de una-Introcan W 20 G) en la aguja, dejando expuesto sólo 1 mm incluyendo la punta abierta de la aguja. Esto evitará que la aguja de perforación de toda la pared ventricular izquierda y la inyección de las células en la cavidad del ventrículo izquierdo.
10. Con la ayuda de un objetivo de 5X, visualizar a este aumento del ventrículo izquierdo e inyectar las células en la pared del ventrículo izquierdo en 5 lugares diferentes (cada inyección entregará 10 ul para un total de 106 células inyectadas). Si la inyección se realiza correctamente, un área blanca y la ausencia de gran lavado de las células serán visibles (si la inyección no se ha realizado correctamente, el animal sería excluido de análisis funcional).
11. Retire el retractor. Cierre la pared torácica by que encierra los dos nervios separados con dos puntos de sutura de seda 6-0.
12. Hidratar los músculos pectorales y la piel con un bastoncillo de algodón empapado en 1x PBS y ponga suavemente los músculos de nuevo en su posición original con las pinzas.
13. Cierre la piel con puntos de sutura 3-4 de sutura de seda 6-0. La sutura la incisión de la garganta con 2-3 puntos de sutura para cerrar la piel.
14. Inyectar atipamezol (1 mg / kg de concentración final) para revertir los efectos anestésicos.
15. Tan pronto como el ratón comienza a respirar de forma autónoma, sacar el tubo de la tráquea y poner el ratón sobre su lado derecho. Se espera que el ratón para recuperarse en cuestión de minutos.
16. Cuando el ratón comienza a girar y caminar, colóquelo en la jaula de recuperación tibia (pequeña jaula IVC con la parte superior filtrada cerrado) durante una hora.
17. Deje a los animales durante la noche en una caja climatizada controlada (37 º C).
18. Llene un recipiente con agua y comida de pellets para apoyar la recuperación durante los primeros 2 días después de la cirugía.

4. Los análisis post-cirugía

Diez corazones inyectados con células y 10 de control corazones no inyectadas se analizan histológicamente como sigue:

1. Realizar análisis de las células injertadas 1 semana después de la inyección (Figuras 1 y 3).
   1. Después de la eutanasia por sobredosis de isoflurano, perfundir los corazones con 20 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) para reparar el tejido. Deshidratar el tejido fijado en el aumento de los porcentajes de etanol (70-100%) e incrustarlo en bloques de parafina.
   2. Sección los corazones en parafina con un micrótomo a 5 micras y se tiñen con hematoxilina y eosina para el análisis morfológico.
   3. Visualizar tejido conectivo usando tinción tricrómica de Masson.
   4. Analizar las imágenes bajo un microscopio escáner de diapositivas (Figuras 1A, 2A, 3A, 3B, y 3C) y visualizar todo el corazón en vista de eje corto usando un microscopio de escáner de diapositivas digitales (Figures 1B y 1C).
2. Después de los análisis anteriores, Desparafinar los tejidos del corazón en xileno, rehidratar sumergiendo las muestras en la disminución de los porcentajes de etanol (a partir de 100% de agua) y el proceso de Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de la siguiente manera:
   1. Incubar bloques desparafinados con ácido tánico al 1% en tampón de fosfato 0,1 M durante 1 hora.
   2. Deshidratar las muestras en el aumento de los porcentajes de etanol (25-100%).
   3. Las muestras secas con HMDS (hexametildisilazano).
   4. Monte los especímenes en Stubbs con Acheson Plata Dag y recubrirlos con oro-paladio.
   5. Ver las muestras en un microscopio electrónico de barrido de análisis (Figura 2B).

Resultados

Hemos inyectado células HEK293, que son distinguibles de las células del corazón por su diferente morfología (Figura 1), con una forma de adoquines en comparación con los cardiomiocitos alargados (Figura 1A). HEK293 células fueron más reactivas a colorante hematoxilina (color azul) en comparación con los cardiomiocitos (color rosa), probablemente debido a su contenido nuclear aumentó (Figura 1A). A fin de distinguir las células inyectadas desde el tejido del huésped, la...

Discusión

En este manuscrito, hemos demostrado cómo llevar a cabo la inyección intramiocárdica de células en corazones murinos. Como prueba de esta metodología, hemos utilizado células HEK293. Es importante destacar que las células HEK293 no se utilizan en cualquier estudio de terapia celular y por lo tanto los resultados de este manuscrito no son apropiados para la traducción directa a un enfoque terapéutico. Sin embargo, el hecho de que las células HEK293 no son células contráctiles y no transdiferenciarse en otros tipos de cél...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistemas	aisladores Pfi		Presupuesto necesario
Almohadilla térmica	Vet Tech Solutions	HE006	Para animales pequeños
Medetomidina	Servicio		Es necesaria receta veterinaria
Clorhidrato de ketamina	Servicio		Es necesaria receta veterinaria
Atipamezol	Servicio Veterinario Nacional	Es necesaria la prescripción veterinaria
Microscopio electrónico de barrido	Jeol	JSM-6610
Tijeras romas	FST	14084-09
Minivent	Harvard Apparatus	73-0043	Incluye adaptador Y pequeño (73-0027) y cánula de intubación (73-2844)
Pinzas	FST	11052-10
Sistema de retracción	FST	18200-20	Kit para animales de hasta 200 g
30 G 12 mm; ½ pulgadas	BBraun	A210
Jeringa de microlitros	ESSLAB	81201	Incluye también un dispensador de repetición Hamilton PB 600-1 Número de catálogo 83700
6-0 Sutura de seda	Ethicon	W1614T

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