La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un In Vitro Ensayo de adherencia

Resumen

En ensayos in vitro de adherencia se pueden utilizar para estudiar la unión de Streptococcus pneumoniae a monocapas de células epiteliales y para investigar las posibles intervenciones, tales como el uso de los probióticos para la inhibición de la colonización neumocócica.

Resumen

La adherencia de Streptococcus pneumoniae (neumococo) para el revestimiento epitelial de la nasofaringe puede dar lugar a la colonización y se considera un requisito previo para las infecciones neumocócicas tales como la neumonía y la otitis media. In vitro ensayos de adherencia se pueden utilizar para estudiar la unión de los neumococos a células epiteliales monocapas y para investigar las posibles intervenciones, tales como el uso de los probióticos, para inhibir la colonización neumocócica. El protocolo descrito aquí se utiliza para investigar los efectos de la Streptococcus salivarius probiótico en la adherencia de los neumococos a la línea celular epitelial humana CCL-23 (a veces referido como células HEp-2). El ensayo implica tres pasos principales: 1) Preparación de células epiteliales y bacterianas, 2) adición de las bacterias a las monocapas de células epiteliales, y 3) detección de neumococos adherente por recuentos de viables (dilución en serie y chapado) o cuantitativa-PCR en tiempo real (qPCR ). Esta technique es relativamente sencillo y no requiere equipo especializado que no sea una configuración de cultivo de tejidos. El ensayo se puede usar para probar otras especies probióticas y / o inhibidores potenciales de la colonización neumocócica y se puede modificar fácilmente para hacer frente a otras cuestiones científicas con respecto a la adherencia neumocócica y la invasión.

Introducción

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una bacteria Gram positiva que puede causar infecciones como la neumonía, otitis media y meningitis. Es una causa importante de enfermedad en niños en los países de bajos ingresos y responsable de un estimado de 800.000 muertes de niños menores de cinco años anualmente ^1. Los neumococos se realizan con frecuencia en la nasofaringe de los niños pequeños. Aunque esta colonización se considera generalmente asintomática, que precede a la infección neumocócica y sirve como un depósito para las bacterias en las poblaciones humanas ^2. La vacunación antineumocócica conjugada reduce efectivamente el transp....

Protocolo

1. Preparación de las células epiteliales y bacterianas

1. Descongelación de CCL-23 células epiteliales
   1. Precalentar mínima Medio Esencial (MEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 37 ° C durante ~ 30 min.
   2. Esterilizar la cabina de bioseguridad cultura aprobados tejido con luz UV durante al menos 10 minutos antes de su uso, y limpiar el área de trabajo con etanol al 70%. Limpie la botella medios calentado con etanol al 70% y el lugar en el gabinete de bioseguridad.
   3. Usando una pipeta de 25 ml, transferir 14 ml de medio en un matraz T-75. Coloque el frasco en 37 ° C incubadora mientras qu....

Resultados

Los resultados de un experimento representativo en el que los neumococos (S. pneumoniae PMP843, un aislado de colonizar 19F) se añadieron a las células CCL-23 1 h después de la adición de S. salivarius, y la adherencia neumocócica se cuantificó por tanto recuento viable y lytA qPCR se muestran en la Tabla 2. Los resultados fueron consistentes entre los dos métodos para tanto el número absoluto de bacterias (presentada como UFC / ml) y la adherencia%, normalizada para el número.......

Discusión

Una parte crítica de este ensayo es la adición de las concentraciones apropiadas de S. salivarius y neumococos en las secciones 3.1.7 y 3.1.12. Las concentraciones se estimaron utilizando lecturas de DO, pero los inóculos exacta no se determinan hasta que las placas se contaron el día siguiente. Por esta razón, se recomienda la realización de curvas de crecimiento para medir OD y los recuentos de viables (UFC / ml) en el tiempo para todas las cepas bacterianas usadas en el ensayo para identificar la fase semilo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios esenciales mínimos (MEM)	Thermo Fisher Scientific	SH30244.01
Suero fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30084.03
T-75 Frasco	Nunc	156472
Células CCL-23	ATCC	CCL-23
Tecnologías de Vida de Tripsina		15090046
Placa de cultivo celular de 24 pocillos	Nunc	142475
Placas de agar sangre de caballo (HBA)	Oxoid	PP2001	Placas de agar sangre de oveja también aceptables
Caldo Todd-Hewitt	Oxoid	CM0189
Extracto de levadura	Beckton Dickinson	212750
Digitonina	Sigma-Aldrich	D141-100MG
Cubetas desechables	Kartell	1938
La heparina	de Pfizer	2112105	se presenta en ampollas estériles de 5.000 UI/5 m/
Esparcidor estéril	Technoplas	S10805050	alternativamente, un esparcidor de vidrio se puede sumergir en etanol al 96% y esterilizar con llama antes de cada uso
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
mutanolisina	Sigma-Aldrich	M9901
Proteinasa K	Qiagen	19133
SDS 20% solución	Ambion	AM9820
RNasa A	Qiagen	19101
QIAamp DNA mini-kit (250)	Qiagen	51306
LytA F imprimación	Sigma-Aldrich	Secuencia	de 5' -> 3' ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R imprimación	Sigma-Aldrich	Secuencia	de 5' -> 3'  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
Sonda LytA	Eurogentec	Hecho a medida	' -> 3' secuencia Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, se pueden utilizar fluoróforos alternativos
Agua libre de nucleasa	Ambion	AM9906
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix	Agilent Technologies	600880
Placa de detección Thermo-Fast 96	Thermo Fisher Scientific	AB-1100
Tiras de tapón qPCR ultraclaras	Thermo Fisher Scientific	AB-0866
Sistema QPCR Mx3005	Agilent Technologies	401449
* Las fuentes alternativas están disponibles para la mayoría / todos los productos enumerados			.