Summary
amphipod Parhyale의 hawaiensis 갑각류 발생학 및 비교 절지 동물의 개발과 진화 연구를위한 유망한 모델 생물이다. 이 프로토콜은 Parhyale의 초기 분열 단계의 배아에서 단일 할구를 수동으로 제거하는 방법을 설명합니다.
Abstract
amphipod Parhyale의 hawaiensis 전세계 조간대 해양 서식지에서 발견되는 작은 갑각류이다. 지난 10 년간 Parhyale은 잘 공부 절지 동물 모델 생물 초파리 melanogaster의에 유용한 외집단 비교를 제공하고, 개발의 실험실 연구를위한 유망한 모델 생물로 떠오르고있다. 초파리의 포체 분열 달리 Parhyale의 초기 분열은 holoblastic이다. 초기 할구에 주입 추적 염료를 사용 운명 매핑은 세 가지 배엽 및 세균 라인이 여덟 세포 단계에 의해 설립되는 것으로 나타났습니다. 이 단계에서, 세 할구는 외배엽으로 야기 운명 아르 세는 중배엽으로 야기 운명, 나머지 두 개의 할구 각각 내배엽 및 세균 계 전구체되어있다. 그러나 할구 제거 실험은 Parhyale 배아는 상당한 규제 capabiliti을 가지고있는 것으로 나타났습니다여덟 세포 단계에서 절제 할구의 운명 나머지 할구의 일부의 자손에 의해 점령 할 수 말이지, 그런 것을. 주입 및 광독성 염료 또는 수동 제거 0098 : 할구 절제는 이전에 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 설명하고있다. 그러나 photoablation은 할구를 죽이고 있지만 배아에서 죽은 세포의 시체를 제거하지 않습니다. 특정 할구의 완전한 물리적 제거 따라서 일부 응용 프로그램 제거하는 바람직한 방법이 될 수 있습니다. 여기에 우리가 살아 그대로 남아있는 할구를 유지하면서 신체의 세포의 완전한 제거에 필요한 악기 및 수동 절차를 설명, Parhyale 배아의 8 세포 단계에서 하나의 할구를 수동으로 제거 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 팔 세포 단계에서, 또는 다른 초기 분열 단계의 할구 어떤 Parhyale 셀에 적용될 수있다. 또한, 원칙적으로이 프로토콜은 초기 클레아에 적용 할 수있다다른 holoblastically 쪼개기 해양 무척추 동물의 vage 단계의 배아.
Introduction
amphipod 갑각류 Parhyale의 hawaiensis 진화 발달 생물학 연구 1에서 사용하기에 큰 잠재력을 가진 유망한 모델 생물로 지난 십 년간 떠오르고있다. 과일. D.에게 초파리 비행하는 절지 동물 중에서 가장 모델 시스템은 곤충, 그리고 가장 광범위하게 이들의 연구 의 melanogaster은 곤충 순서 Diptera의 멤버이며, basally 분기 곤충 2와 관련하여 파생 된 이러한 표시 많은 발생 학적으로 특징. 또한, 곤충 곤충 pancrustaceans라는 오랜 "자연"그룹 내에서 자신의 가장 가까운 친척이 있다는 것을 의미 아문 Pancrustacea 3 중첩하고,이 그룹 paraphyletic입니다됩니다. 이 외에도 basally 곤충 모델을 분기 할 것을 제안, 다른 갑각류의 연구 개발 특성의 진화 역사의 넓은 시각을 얻기 위해 필요합니다잘 D.에서 공부 한 차 분자 메커니즘 의 melanogaster. 그러나, 거의 갑각류 잘 개발의 실험적인 실험실 분석을 위해 설립되었다. amphipod P. hawaiensis 실험 기술의 범위에 순종 매우 다루기 쉬운 실험 모델 시스템이다. 갑각류는 상위 superorder Peracarida (비치 호퍼, 스커드, 잘 새우) 내에서의 다양하고 독특한 기능을 표시하고, 따라서 상대적으로 갑각류의이 그룹 내에서 파생 된 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, Parhyale에서 제공 학적 및 기능적 유전자 조작의 상대적 용이성이 amphipod 모델 생물의 현재 재고에 귀중한 추가합니다.
실험실 동물, P.로 hawaiensis는 많은 장점을 제공합니다. 동물은 온도와 염분의 광범위한 관용, 인공 해수 1의 큰 문화에 잘 남아있다. 그것은 betw 구별하기 쉬운명확한 형태 학적 차이, 짝짓기하는 동안 암컷을 파악하는 데 사용하는 수컷 특히, 대형, 후크, 전방 트렁크 부속에 따라 EEN의 남성과 여성. 배아 발달 작업, P. hawaiensis 몇 가지 매우 매력적인 기능을 가지고 있습니다. 배아는 대략 10 일을 지속하고 성적 성숙에 시간이 28 º C에서 약 6 주입니다 (하지만 Parhyale 약 20 ~ 30 º의 C에 이르는 온도에서 잘 살아 있습니다, 그 상세한 개발 준비 정보는 18 º C 4에서 제기 배아 사용할 수 있습니다 25 º C에서 4, 26 º C 5,6). 성인은 실험실에서 일년 내내 짝짓기, 그래서 배아는 일년 중 언제든지 가능합니다. 여성은 처음 몇 다리 쌍 (그림 1A와 1B)간에있는 복부 알주머니로 수정란 (여성의 나이)에 따라 2-20을 마련하고, 이들 배아를 수집 할 수 있습니다여성을 살해하거나 배아 (그림 1C)을 손상시키지 않고 초기 개발이야. 배아는 부화를 통해 여과 인공 해수에서 생존 이후의 유전자 발현 또는 조직 학적 분석 7 고정 할 수 있으며, 자세한 준비 테이블 개발 (5)를 통해 진행 상황을 정확하게 식별 할 수 있습니다. 강력한 프로토콜 현장 하이브리드 8-15 또는 4,16,17를 면역 염색에 의해 유전자 발현 분석을 수행하는 데 사용되었습니다, RNA 간섭 (13, 15) 또는 morpholinos와 12 및 안정 세균 라인으로 기능 최저는 18 형질 전환. 형질 전환 시스템, 유도 식 14 및 19의 방법은 또한 P.의 유전자 기능을 연구하기 위해 이용 될 수있는 인핸서 트랩을 사용 hawaiensis. 공개 된 게놈 시퀀스는 현재 사용할 수 없습니다 있지만, 난자 및 배아 동안 생산 된 성적 증명서를 포함하는 전 사체는 꿀벌을 가지고N 드 노보 조립 및 20 주석, 유전자 발견을 용이하게 검색 할 수있는 데이터베이스 (21)에 입금. 요컨대, P. hawaiensis 개발을 이해하는 여러 실험과 유전자 접근 방식에 적합한 매우 다루기 쉬운 모델 생물이다.
D의 초기 세포 융합 분열과 달리 의 melanogaster, P. hawaiensis 배아 holoblastically 수정 (그림 2A)를 다음 절단. 리니지 추적 분석은 세 번째 분열에 의해, 세 번째 분열 할구 각각 구체적으로 세 가지 세균 층의 하나 또는 세균 라인 (6) (그림 2B)로 야기 운명되는 것으로 나타났습니다. 이러한 데이터는 함께 마이크로 어레이 데이터 (22)와, 세포 계보는 6,23를 분석하고 할구 분리 실험 4는 개발 잠재력이 CEL의 비대칭 상속에 의해 적어도 일부의 세 번째 분열 할구를 분리합니다 것을 제안했습니다L 운명 결정. 세포의 부재로 표시된 바와 같이 따라서, (Parhyale 세포 계보 명명법 6에서 "g"라고) 세균 라인 전구체 팔 세포 단계에서 제거되는 할구 박리 실험에서, 배아는 나중에 개발 단계 4에서 생식 세포가 결여 대부분의 후생 동물 (24)의 세균 라인 마커 단백질 바사을 표현. 대조적으로, 체세포 할구 절제 실험은 보여 주었다 P. hawaiensis 배아는 상당한 규제 기능을 가지고 여덟 세포 단계에서 절제 중배엽 또는 외배엽 전구체 할구의 운명은 나머지 할구 (25)의 일부의 자손에 의해 인수 될 수 있도록. 어떻게 규정하는 세포의 운명 교체가 발생할 수 및 체세포 할구에 의한 자율적 인 세포의 운명 채용의 정도는 알 수없는 남아있다. 이러한 할구 절제와 같은 실험 발생학 기술은 understan에 유용 할 수 있습니다딩은 상대적 자율성과 세포의 운명 결정 (26, 27)의 nonautonomy 및 P.의 연구에 관심 그러므로입니다 hawaiensis의 배아.
외배엽 및 중배엽 계통의 규정하는 대체를 보여 실험에서 할구 절제 사출 (28)과 광독성 염료 (25)의 다음 여기에 의해 수행되었다. 이 기술은 주입 된 할구 (들)을 죽이는 효과가 있지만, 그것은 완전히 배아에서 죽은 세포의 시체를 제거하지 않습니다. 또한, 차이는 세포 계보 형광 계보 트레이서 (28, 29)와 할구를 주입하여 배아의 낭 배기 단계를 통해 수집 된 데이터를 동일한 배아 단계 23의 개발을 통해 교란 할구에 따라 수집 된 데이터 사이에 관찰되었다. 특정 할구의 완전한 물리적 제거 따라서 일부 응용 프로그램 제거하는 바람직한 방법이 될 수 있습니다.
우리는 이전에 세포 계통의 결과를 발표하는 것은 하나의 세포가 수동으로 23을 절제 하였다있는 배아의 분석. 그러나, 초기 분열 단계의 배아에서 단일 할구를 제거하는 데 필요한 섬세한 작업은 아직 완전히 설명하지 않았다. 여기에서 우리는 P.의 수집을위한 프로토콜을 제시한다 hawaiensis 배아와 여덟 세포 단계의 배아에서 하나의 할구를 수동으로 제거. 이 방법의 목적은 셀룰러 동작 및 배아 발생 및 후 배아 발달 동안 남아있는 세포의 세포 운명 역량의 관찰을 허용 배아에서 전지 본체의 완전한 제거를 달성하는 것이다. 우리 프로토콜 세균 선 g 전구체 (도 2c)의 제거를 도시하지만, 이하 절단 단계 할구에, 팔 세포 단계에서 모든 셀에인가 될 수있다. 원칙적으로,이 프로토콜은 인접 초기 분열 단계 배아에서 단일 세포를 제거하도록 적용될 수있다R holoblastically 해양 무척추 동물을 쪼개기.
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Protocol
특정 단계를 실행에 도움이 될 수있는 댓글은 이탤릭체로 표시됩니다.
1. 1 일 : 재료의 제조
- 다음과 같은 물질을 (재료 및 장비의 표 참조) 준비
- 15cm와 22cm 파스퇴르 피펫
- 다이아몬드 필
- 필터링 된 인공 해수 1 ㎎ / ㎖ 암포 테리 신 B (100 ㎎ / ㎖의 원액 1:100) 100 단위 / ㎖ 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 (원액 1:50 포함 (0.0018-0.0020 사이 염분) 페니실린의 5000 단위 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 5000 ㎎ / ㎖ 함유)
- 첨가제없이 필터링 인공 해수 (0.0018-0.0020 사이 염분)
- 주택 커플을위한 큰 플라스틱 용기 (최소 15cm X 15cm X 5cm)
- 실 가드 늘어선 작은 (3 cm 또는 5cm) 페트리 접시
- 작은 (3 cm 또는 5cm) 페트리 접시
- watchglass 또는 유리 멀티 웰 플레이트
- 집게 (우리가 사용하는 무딘 집게 이리저리 유도실수로 우리가 집게의 끝은 모두 타인이 동일한 길이 있다는 것을, 부드러운 보장하기 위해 돌을 날카롭게 집게를 사용하여, 그들은 더 이상이 없다는으로 용도를 변경 한 다른 실험 절차에 손상되었다 m 오래 뒤몽 # 5 포셉 날카로운 포인트. 이러한 새로운 뒤몽 # 5 포셉으로 매우 미세 집게는, 그들은 배아 및 / 또는 여성을 손상 수 있으므로 바람직하지 않다.)
- 끝 파스퇴르 피펫 (아래 단계 1.2 참조) 확대
- 파스퇴르 피펫의 얇은 단부로 매립 얇은 만곡 텅스텐 와이어로 이루어진 배아 검색 도구는 (구현 대안으로 대체 될 수있다; 아래 1.3 참조)
- 작은 구멍과 입 피펫 (아래 단계 1.4 참조)
- 뽑아 유리 모세관으로 만든 유리 바늘 (아래 단계 1.5 참조)
- 다음 확대 파스퇴르 피펫, 피펫, 다이아몬드 필 좁은 손가락을 보호하기 위해 킴 와이프 종이 타월에 피펫의 득점 영역을 래핑하는 시작하는 지점에서 15cm 파스퇴르 피펫 주위에 먼저 점수, 그리고 신중하게하십시오 점수 선에서 끝을 해소. 가장자리를 다듬는 데 몇 초를위한 분젠 버너의 불꽃에 피펫의 깨진 끝을 잡고. 개구는 피펫의 최대 폭보다 약간 좁게한다.
- 텅스텐 와이어 해부 도구를 만들려면 15cm 유리 파스퇴르 피펫의 끝 부분에 텅스텐 와이어를 삽입 한 유리를 용융 분젠 버너의 불꽃을 통해 짧게 잡고, 장소에 전선을 고정. 갈고리 모양으로까지 부드럽게 곡선 와이어의 끝에 집게를 사용합니다. 이 도구에 대한 적절한 형상의 예를 들어 그림 3을 참조하십시오.
- 입 피펫을위한 작은 구멍을 만들려면, 두 부분의 오븐에 22 센티미터 파스퇴르 피펫의 얇은 끝을 당겨불꽃과 작은 쪽의 끝을 해소 어. 입 피펫 홀더의 끝 부분에 삽입합니다.
- 바늘 풀러를 사용하여 절제 절차 중에 그 할구를 천공하는 데 사용될 유리 바늘을 만든다. 적절 형 바늘도 4에 도시된다. 이 바늘이 배는 매개 변수를 사용하여 프로그램을 사용하여 셔터의 P97 바늘 풀러에 당겨졌다 (열 = 566, = 100 당겨 속도 = 20 = 250 시간) + 1X (열 = 566, 당겨 = 100, 속도 = 100 시간 = 250). 아직 또한 태아의 융모막에 밀어 때 중단하지 않을 정도로 튼튼한 수, 바늘을 만드는 데 사용되는 특정 프로그램과 장비는 다양 할 수 있지만, 바늘이 좋은 지점이 있어야합니다.
2. 1 일 : 수집 Parhyale 연결 커플
- P. 짝짓기 수집 확대 파스퇴르 피펫 (단계 위의 1.2)를 사용하여 hawaiensis의 큰 배양 용기에서 커플, 별도의 컨테이너에 포함 된 C로 전송인공 해수를 숙이고. 그것은이 해수를 여과 할 필요는 없다. 그것은 나중에 오후에 짝짓기를 수집하고 다음날 아침, 대부분의 태아는 최근 수정 된 및 입금, 따라서 초기 분열에서 한 수 있도록, (20 ~ 23 º C) 실온에서 하룻밤 커플을 두는 것이 가장 좋습니다하기에 적합한 스테이지 절제. 일부 여성은 다음 날 아침 일찍 분열 단계의 배아를 운반 할 수 있도록 최소 20 짝짓기를 수집합니다.
3. 주 2 : 수집 Parhyale 태아
- 다음 날 아침, CO 2로 여과 인공 해수 (FASW)를 주입. 여성 중 일부는 밤에 자신의 남성에서 무료로 수영 할 것이다, 이러한 분리 여성을 수집하고 FASW / CO 2를 마취. 나머지 비공유 수컷 쌍 짝짓기 용기로부터 제거하고 대규모 배양으로 돌려 보내질 수있다. 남은 짝짓기 나중에 배아 수집을 위해 저장 될 수있다당일 또는 다음날.
- FASW / CO 2의 시계 접시에 배아를 들고 하나의 마취 여성을 전송합니다. 모든 분리 된 여성은 가능성이 여성의 투명 coxal 플레이트 (그림 1A)를 통해 옅은 분홍색이나 보라색 상체와 같은 눈으로 볼 수있는 달걀을 기탁 한 것이다. 배아 초기 분열 단계에서와 할구의 절제하여 적합한 지 확인하기 위해 연구원은 알주머니에서 배아를 제거하고 현미경을 검토해야합니다.
- 해부 현미경 절차 관찰, 집게로 몸체의 일측을 따라 coxal 플레이트 잡기. 태아는이 coxal 판 (도 1b) 사이의 복부 알주머니에 볼 수 있습니다.
- 알주머니의 후방 끝으로 조심스럽게 무리를 분리하는 알주머니의 앞쪽 끝으로 전선을 들어 올려 얇은 곡선 선 도구 (위의 단계 1.3 그림 3)를 삽입현관 깔개 (이 30 oostegites 불리는 복부 부속을 수정), 주머니를 열고 배아를 풀어. 이 막 달걀 누워 후 약 2 ~ 3 시간에 의해 사라지고, 배아는 결합하지 않는, 모두가 쉽게 선 도구에 의해 중단 될 것입니다 매우 얇은 투명 막 내에 포함되어 배치되는 첫 번째 시간 정도 내에있는 태아 서로에게 또는 어떤 방식으로 여성에 배아에 걸쳐 이후이 시점에서. 연구진은이 불편하거나 어려운 알주머니에서 배아를 제거하는 곡선 된 와이어 도구를 기동 찾을 경우, 대안은 한 움직임이 부드러운 및 가혹한 압력이 배아 또는 알주머니에 적용되지 않는다 것과 같이, 사용할 수 있습니다 구현합니다. 알주머니에서 배아를 제거하기위한 적절한 다른 도구는 무딘 집게 또는 밀봉하고 부드럽게 끝이 유리 모세관 (가) 있습니다.
- T를 밀어 열린 알주머니를 통해 물을 세척하기 위해 변경되지 않은 15cm 파스퇴르 피펫을 사용하여그는 시계 접시의 바닥에 침전해야하는 배아. 주 문화에 그녀를 재 도입하기 전에 복구를 할 수 있도록 (CO 2)없이 FASW을 청소하는 여성을 전송합니다. 다수의 여성은 같은 복구 접시에 놓여 있지만, 여전히 부분적으로 마취를하는 경우가 다른 동물에 의해 먹게 될 수 있으므로 여성은, 주 문화를 반환하기 전에 완벽하게 복구 할 수 있습니다.
- 깨끗한 FASW와 페트리 접시에 배아를 전송하고, 자신의 배아 단계를 결정하기 위해 현미경으로 볼 수 변경되지 않은 15cm 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 이 절차에 적합한 세 번째 분열 (단계 5)에 있습니다 별도의 배아. 그것은 또한 종래 세균 디스크 포메이션 어떤 분열 단계에이 프로토콜을 적용 할 수 있어야한다 (5월 7일에서 8일까지 스테이지).
4. 주 2 : 탄두 싱글 셀
- FASW의 얕은 층으로 실 가드 늘어선 페트리 접시를 채우십시오. 변경되지 않은 15cm 파스퇴르 파이를 사용하여pette 플레이트에 하나의 배아를 전송합니다.
- 무딘 집게를 사용하여 부드럽게 절제하는 셀 (도 2a 및도 2b)를 식별하기 위해 배아를 구른다. 세균 라인 전구체 G는 작은 macromere의 MAV 위에 앉아 작은 micromere으로 식별 할 수 있습니다. 또한, G는 직접 중배엽 전구체 micromeres의 ML 씨와 공유로 배아의 중간에 셀 테두리가. 씨가 G의 오른쪽에있는 할구, 그것에서 직접 걸쳐 micromere 인, 욕실 셀을 연락하고,하지 않습니다 밀리리터 g의 왼쪽 micromere이다. 씨, ML, 및 EN의 자매 macromeres는 외배엽 전구체 각각 어, 엘, 및 EP 있습니다.
- LEF에서 집게로연구원은 오른 손잡이 인 경우 t 손 (또는 오른쪽에있는 연구원이 왼손잡이 경우), 오른쪽으로 관심의 세포와 배아의 방향 (또는 왼쪽에있는 연구원이 왼손잡이 경우) 부드럽게 안정 집게 사이의 배아를 파악.
- 뽑아 유리 바늘 (위의 단계 1.5, 그림 4)를 사용하여 조심스럽게 관심의 세포에 구멍을. 이웃 세포로 또는 관심의 세포 아래에 바늘을 밀어하지 않도록, 너무 멀리 바늘을 삽입하지 마십시오. 니들 만 융모막 및 내부 세포막를 천공 가지며, 절제 할 셀에 깊게 확장 할 필요가 없다.
- 교환 벌금 입 피펫의 유리 말의 배에 구멍을하는 데 사용되는 바늘은 파스퇴르 피펫 팁 (위의 단계 1.4)를 꺼냈다. 관심의 세포에서 생성 된 구멍에 가까운 피펫의 끝을 잡고, 매우 부드러운 흡입을 적용합니다.
- 아주 부드럽게 집게와 배아를 짠다. blasto의 내용으로단순한는 단계 4.4에서 만든 구멍을 통해 융모막 밀려 배아의 탁 트인 전망을 할 수 있도록 입 피펫으로 빨아된다. 구멍이 충분히 큰 경우, 천공 된 세포의 핵은도 등장하는 것으로 될 수있다. 이것은 전체 셀 내용이 삭제되었습니다 다시 생성 할 수 있는지 확인하는 것이 확인하는 것입니다.
- 관심의 할구를 제거주의 깊게 배아를 관찰합니다. 구멍이 셀의 테두리가 보이지 기본 세포의 교차점을 만들고, 융모막의 구멍쪽으로 후퇴 할 것이다. 관심의 할구 모두 제거 될 때까지 압력을 계속 적용. 좌우로 배아를 롤 집게를 사용하여 시각적으로 관심의 할구 모두 사라인지 확인합니다.
- 변경되지 않은 15cm 파스퇴르 피펫을 사용하여, (FASW + 1 ㎎ / ㎖ 암포 테리 신 B, 100 단위 / ㎖ 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신) FASW + 청소 배아를 전송합니다.
- 개인 우물에서 할구 - 절제 배아를 올립니다FASW +의 깨끗한 48 - 웰 플레이트의 매일 항생제 보충 FASW +의 50 %를 변경. 우리 손에 배아는 생존과 18 ~ 28 º C.의 온도 범위에서 잘 심지어 다음 제거를 개발 연구자들은 최소한의 방해로 배아를 육아에 깨끗한 (그러나 반드시 멸균되지 않음) 표면이되는 온도에서 자신의 배아를 제기해야합니다. 컨트롤 할구 - 절제 배아 발달 이벤트의 타이밍을 비교할 수 있으려면, 우리는 18 º C 4, 25 º C 4에서 제기 배아 가능합니다 자세한 개발 준비 정보에 독자를 참조, 26 º C 5,6.
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Representative Results
하나의 세 번째 분열 P.의 성공적인 절제 다음 이 프로토콜에 설명 된 것처럼 이전에 부분적으로 절제된 할구가 차지하는 공간을 점유하도록 hawaiensis의 micromeres는 나머지 micromeres 서서히 약간 자신의 위치를 이동. g이 제거 될 때 예를 들어, 할구 미스터 이웃과 약간 시프트 및 g와 직접 접촉 (도 2A 및 2C와 비교)에 이전되었습니다 횡 셀 테두리 나누어지는 밀리리터. 성공적으로 제거 후, 나머지 할구는 네 번째 분열에 들어가기 전에 (한 시간 미만) 약간의 지연을 표시 할 수 있지만, 그 같은 분열 패턴과 그들이 적어도 낭 배기까지 조작되지 배아에 표시했을 것이라고 타이밍이 23 스테이지를 다시 시작해야합니다 . 네 micromeres, 나머지 blasto의 자손의 다음 제거meres는 "장미"와 낭 배기의 움직임 (23)의 시작이라고 특성 세포 배열의 형성을 포함하여 정상적인 분열 타이밍 및 세포 행동을 보여 주어야한다. 부화를 통해 제거 절차 및 완전한 배아 생존 배아의 비율은 초기 기술에 대한 새로운 연구에 대한 10 %의 순서에있을 수 있지만, 경험이 약 50 %를 평균한다, 75 %로 높은 수 할구 절제를 다음 배아의 연습과 경계주의. 표 1은 절제 배아의 수와 그 생존율은 처음 몇에 대해 일반적으로 80 % 이상이다 보여주는 같은 연구원에 의해 수행 연속 절제 일련의 실험에 대한 생존율의 예를 보여줍니다 일 연구자의 증가 경험 상승을 부화에 이르기까지 절제, 그 생존율을 다음.
할구 불완전한 제거는 것아직 태아의 융모막에 위치한 막 구성 요소, 세포질, 또는 노른자위 과립을 포함 할 수 절제되어 있어야 할구의 잔해를 볼 수에 의해 입증. 두 시간 이상, 또는 불규칙한 절단 패턴이나 나머지 할구의 자손 세포 행동의 네 번째 분열의 지연은 또한 실패 절제를 나타낼 수 있습니다. 이러한 현상은 절제 절차를 수행하는 동안 다른 할구로 인한 손상의 결과 일 수있다. 절제 표시 형태 학적 이상을 대상 하나 손상 후 다시 분해 이외의 할구 가능성이 제거 절차를 수행하는 동안 다른 할구로 인해 발생 된 경우.
세포의 운명 마커 운명을 규정하는 대체 적용되지 않습니다 특정 제 분열 할구의 후손에 라벨을 사용할 수있는 경우, 성공적으로 절제 한 후 추가로 확인하는 마커 FOLLO으로 표시 조작 배아를 얻을 수있다윙 절제. 일부 중배엽과 외배엽 지역의 마커는 배아 8,14,15의 말기에 중간에 설명되어있다. 이러한 세균 층의 모두가 자신의 설립자 할구 (25) 중 하나의 손실에 따라 규정하는 교환을받을 수 있기 때문에, 이러한 마커는 명확하게 절제가 성공 할구 여부를 결정하지 않을 수 있습니다. 세균 라인 전구체 (G)의 경우, 모든 하위는 바사 성적 증명서 (12)와 배아에 걸쳐 단백질 4의 식으로 표시, 초기 배아 밴드 적어도 통해 부족의 생식 세포를 절제 된 G의 배아는 4 스테이지됩니다. G의 성공적인 절제 따라서 배아의 나중 단계에서 제거 (그림 5) 다음 바사 식을 검사하여 확인할 수 있습니다.
SRC = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg"SRC = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg"/> : FO 번째는 = "5 인치"
그림 1. 성인 Parhyale 여성과 태아 hawaiensis. (A) 성인 여성 (P)의 측면보기 hawaiensis, coxal 판 (화살표)를 표시, 흉부 부속 (화살촉)와 투명 coxal 판 (파란색 점선)을 통해 분홍색이나 보라색 상체로 볼 배아. 전방 왼쪽에 있습니다. 성인 여성 P.의 (B) 복부보기 hawaiensis 알주머니 (파란색 점선)에 표시 배아를 표시합니다. 전방 왼쪽에 있습니다. 알주머니에서 출시 (C) 배아 FASW에서 일반적으로 개발합니다. . S1에서 부화를 통해 이르기까지 단계의 다양한이 표시되어, 브라운 등 5 스케일 바 = 1 (A)의 MM, (B)에 따라 단계적 (C)에서 500 μm의.51073/51073fig1highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. P. 여덟 세포 단계의 배아 hawaiensis. (A) 네 micromeres (작은 세포)과 네 개의 macromeres (큰 세포)를 포함, (단계 S4 5를) 조작되지 배아를 여덟 세포 단계를 살고 있습니다. (B) 형광 마커 6을 기준으로 추적 혈통으로 계시 된 야생 형 배아의 모든 할구의 세포 운명의 지정을 표시하는 여덟 세포 단계의 배아의 도식. (C) 다음에, 본 프로토콜을 사용하여 제거 G의 할구를 가지고 S4 단계의 배아를 살고 있습니다. 원이 지역은 이전에 G의 할구에 의해 점유 된 영역을 보여줍니다;나머지 micromeres 약간 g의 박리의 결과로서 위치를 이동 하였다. 스케일 (A)에서 = 250 μm의 바 (C)가. 이러한 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 알주머니에서 배아를 제거하기 위해 사용 와이어 도구입니다. 여기에 표시된 도구는 완만 한 곡선을 소개하는 집게를 사용 후, 파스퇴르 피펫의 좁은 끝 부분에 텅스텐 와이어를 삽입하고 조심스럽게 제자리에 와이어를 밀봉 유리를 용융에 의해 만들어진 와이어에. 알주머니에서 배아를 제거하기위한 적절한 다른 도구는 무딘 집게 또는 밀봉하고 부드럽게 끝이 유리 모세관 (가) 있습니다. 사우스 캐롤라이나= 1cm 맥주 바.
그림 4. 유리 바늘이 제거 절차를 수행하는 동안 할구를 천공에 사용됩니다. 여기에 표시 바늘이 매개 변수 2 개를 가진 프로그램을 사용하여 셔터의 P97 바늘 풀러에 당겨졌다 (열 = 566, = 100 당겨 속도 = 20 시간 = 250) + 1 개 (열 = 566 시간 = 250, 속도 = 100, = 100 당겨). 다른 악기 또는 프로그램은 한 그들은 여기에 표시된 것과 동일한 일반적인 형상이기 때문에, 박리에 적합한 바늘 당겨하는데 사용될 수있다. 스케일 바 = 1 CM.
그림 5. 할구의 결과를 평가blation 배아 동안. (A) 곧 반 바사의 면역 염색 (화살촉)로 표시 생식 세포를 표시, 부화하기 전에 야생형 단계 S29 태아의 생식선 지역입니다. 여기에 사용되는 항 바사 항체 P.에 특정 hawaiensis 바사 (Linsler, Alwes 및 Extavour, 게시되지 않은 데이터). (B) 생식선 지역 (화살촉)의 특정 안티 바사 신호의 부재로 계시 된 생식 세포의 부재를 보여주는 8 개의 세포 단계에서 제거 G의 할구를 가진 단계 S29 태아의 생식선 지역. 스케일 (A) = 100 μm의에 바 (B)에도 적용이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 절제 라운드 | # 절제 | # (%) 살아50 % 개발 | # (%)을 90~100% 개발에 살아 |
| 1 | 49 | 41 (83.7) | 6 (12.2) |
| 2 | 48 | 46 (95.8) | 17 (35.4) |
| 3 | 31 | 25 (80.6) | 22 (71.0) |
| 4 | 97 | 72 (74.2) | 56 (57.7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60.2) |
| 6 | (50) | 36 (72.0) | 37 (74.0) |
| TOTAL | 383 | 320 (83.6) | 203 (53.0) |
표 1. 대표 절제 생존통계는. micromere 절제 후, 생존 (25 º C에서 10-12일) (25 º C 5 ~ 6 일간) 개발의 첫 번째 50 % 내에서 다음 90-100% 개발에서 모두 득점했다. 절제는 1-6 8 개월 동안의 과정을 통해 시간 순서대로 단일 연구원 (AR 스트)에 의해 수행 실험의 대표적인 예이다 반올림합니다. 경험 90~100% 개발 증가로, 여기 생존율을 같이 연구원은 그것을 찾을 수 있어야합니다.
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Discussion
우리는 수동 제거 및 amphipod P.의 초기 분열 단계에서 단일 할구의 완전한 물리적 인 제거를위한 프로토콜을 설명 hawaiensis. 우리는 여덟 세포 단계의 배아에서 단일 배아 줄 전구 세포의 g를 제거하여이 의정서의 사용을 설명하고, 절제 나중에 배아에서 g의의 딸 세포의 유무를 확인하여 성공했는지 보여줍니다. 이 프로토콜은 초기 분열 단계에서 배아로부터 micromeres 중 하나를 제거하는데 사용될 수있다. 첫 번째 또는 두 번째 분열 단계에서이 단계에서 macromeres 또는 할구를 제거하기 위해 이러한 프로토콜을 사용하기 위해, 사용자는 단순히 단계 8.8에서 융모막에서 약간 큰 구멍으로 만들고, 더 긴 시간 동안 압력과 흡입을인가 약간의 수정을 적용 할 수있다 단계 4.6에서 셀 내용의 큰 볼륨을 제거합니다. 우리는이 프로토콜을 사용하는 다음, 절제 후 남은 할구의 개발이되지 않은 것으로 나타났습니다적어도 낭 배기 (23)의 시간까지 분열 및 세포의 움직임 패턴에 대하여 영향.
이 프로토콜은이 amphipod 초기 분열 할구의 개발 가능성에 계속 조사를 위해 도움이 될 수 있습니다. 많은 질문은 어떤 세포가 아닌 다른 사람이 절제 할구의 사람들을 대체하는 운명을 바꿀 수있는 이유를 포함하여,이 분야에서 답변 남아,이 규정하는 변화의 정확한 타이밍과 메커니즘. 프로토콜은 단순히 그 할구 순차 단계 4.2-4.7를 반복함으로써, 하나 이상의 셀의 절제를 수용하도록 수정 될 수있다.
그것은 초기 분열 할구를 정확하게 식별하기 위해 적절한 조명 고품질 실체를 사용하는 것이 중요하다. 우리는 광섬유 차가운 광원에서 측면 사건 흰색 빛이 목적에 가장 유용하다는 것을 찾을 수 있습니다. 직접 SPECIM 위의 입사광투과광 배아 할구의 밀도 노른자에 침투하는 데 실패하면서 엉이, 세포 형태학 및 경계를 모호하게 할 수 반사를 만들어 따라서 구별하기가 어렵습니다. 이 창백한 태아에 가장 대조를 제공하기 때문에 그것은, 시계 유리 또는 검은 화면이 아닌 흰색 또는 투명 유리 표면에 배치 할 배아를 포함하는 페트리 접시에 가장 도움이됩니다.
이 프로토콜에 대한 하나의 제한은 관심의 할구 정확하고 명확하게 절차를 시작하기 전에 확인해야한다는 것입니다. Photoablation 기술 연구원 시스템을위한 새로운 배아 형광 염료 (28)의 주입을 다음 몇 분열주기를 개발하기 위해 남겨 둘 수 있고, 주입 할구의 ID가 포스트 분사를 확인하기 때문에, 더 유용 할 수 있지만 photoablation 전에 것 잘 이전 세포주에서 설명 된 셀룰러 후손의 패턴을 분석함으로써나이는 6,23를 분석합니다. 연구원은 P.에 익숙해지면 hawaiensis 배아와 자신감을 가지고 모든 할구를 식별 할 수있다, 여기에서 설명하는 수동 제거는 오히려 배아에서 죽은 세포의 시체를 제거하지 않고 세포를 죽이는 것보다 할구의 완전한 물리적 인 제거가 바람직하다 응용 프로그램에 사용될 수 있습니다.
이 절차는 원칙적으로 다른 holoblastically 쪼개기 갑각류의 분열 단계의 배아, 또는 그 chorions 또는 수정 세포막을 쉽게 제거 할 수없는 다른 해양 담수 무척추 동물에서 하나의 할구를 제거하기 위해 적용 할 수 있습니다. 수정은 적절한 염분 특성과 배양 미디어를 사용하고,보다 섬세한 막 (이상, 얇은 바늘) 또는 더 강력한 배아 코팅 (짧은, 빠른 속도로 바늘을 가늘게)을 수용하기 위해 바늘의 모양을 수정 포함될 수 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 카메라 작업에 Tripti 굽타와 Frederike Alwes 세포 제거 기술을 정제 도움, 데이터, 비디오 및 원고에 대한 의견을 Extavour 실험실 구성원을 Rayhan 아리프와 Hassaan Shahawy 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 하버드 줄기 세포 연구소에 의해 지원되었다 (씨 그랜트 번호 SG-0057-10-00) 엘리슨 의료 재단 (새로운 학술 보너스 번호 AG-NS-07010-10) CGE에, 하버드 대학 연구 프로그램 상에 ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
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