Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.
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Artículo de método
Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción
En este artículo
Resumen
Resumen
Codetection célula individual de un gen, su producto de ARN y proteínas reguladoras celulares es fundamental para estudiar la regulación de la expresión génica. Este es un reto en el campo de la virología, y en particular para los virus de ADN persistentes nucleares-replicantes que involucran modelos animales para su estudio. Tipo de virus del herpes simple 1 (VHS-1) establece una infección latente de por vida en neuronas periféricas. El virus latente sirve como reservorio, de la que se reactiva e induce un nuevo episodio herpética. La biología de las células de HSV-1 latencia sigue siendo poco conocida, en parte debido a la falta de métodos para detectar HSV-1 genomas in situ en modelos animales. Se describe un ADN de hibridación in situ fluorescente (FISH) enfoque detectar de manera eficiente bajo número de copias de genomas virales dentro de las secciones de los tejidos neuronales de modelos animales infectados. El método se basa en el antígeno desenmascarar a base de calor, y las sondas de ADN caseras directamente etiquetados, o sondas disponibles en el mercado. Hemos desarrollado una triple staienfoque ning, combinando ADN-FISH con ARN-FISH e inmunofluorescencia, utilizando amplificación de la señal peroxidasa basado para dar cabida a cada requerimiento de la tinción. Una mejora importante es la capacidad para obtener, dentro de 10 micras secciones de tejido, las señales de baja fondo que se pueden obtener imágenes en alta resolución por microscopía confocal y de campo amplio de epifluorescencia convencional. Además, la triple tinción trabajó con una amplia gama de anticuerpos dirigidos contra proteínas celulares y virales. El protocolo completo tarda 2,5 días para dar cabida a anticuerpo y penetración de la sonda dentro del tejido.
Introducción
Tipo de virus del herpes simple 1 (VHS-1) es un virus neurotrópico humano persistente, establecer una infección latente a largo plazo en las neuronas de los ganglios del trigémino (TG) del sistema nervioso periférico, de la que se reactiva periódicamente para replicar y propagarse. El HSV-1 del genoma es un ADN de doble cadena 150 kb de localización en el núcleo de la neurona de acogida donde permanece plásmidos cromatinizados como multicopia, que no se integran en el genoma de la célula huésped 1,2. Durante la latencia, el programa genético de HSV-1 ciclo de replicación está fuertemente reprimida, y la expresión génica está restringida a la transcri....
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Protocolo
Este método se utilizó en un estudio publicado previamente 22. Para el fondo general y descripción de la manipulación convencional en ISH, IF y FISH, sugerimos la siguiente bibliografía disponible 23.
1. Infección Animal
Todos los procedimientos con animales experimentales se ajustaban a las cuestiones éticas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el uso de animales en la investigación, y fueron aprobados por el comité de ética local de la UPR-3296-CNRS, de acuerdo con la Comunidad Europea Directiva 86/609/CEE del Consejo. Todos los animales ....
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Resultados
Después de varios meses de extensas pruebas, descubrimos que desenmascarar química basada en el calor hizo latente HSV-1 genoma disponible para la hibridación fluorescente in situ. Durante el proceso, hemos intentado diversos procedimientos desenmascarar y tratamientos sólo en base al calor (es decir, el calentamiento de las secciones hasta la temperatura sub-ebullición en un horno de microondas) aparecimos eficiente. A continuación, prueba varios tampones de sal que se utilizan rutinariamente.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí permite la detección de HSV-1 del genoma latente dentro de las neuronas de ratón secciones de tejidos neuronales. Nuestra comprensión de las vías que regulan la expresión de genes virales se ha visto limitado por la falta de método para detectar el HSV-1 ADN genómico in situ dentro de los tejidos neuronales. La información sobre el número de copias del genoma y la proporción de las neuronas infectadas provino principalmente de análisis de PCR en las neuronas disociadas 1.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Damos las gracias a N. Sawtell (Centro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati, Cincinnati, Ohio, EE.UU.), S. Efstathiou (Universidad de Cambridge, Reino Unido) y James Hill (LSU Health Sciences Center, Nueva Orleans, EE.UU.) para proporcionar muestras de HSV-1 infectados con ratones y conejos, respectivamente, y para los reactivos; H. Masumoto (Instituto Kazusa DNA Research, Chiba, Japón) y S. Khochbin (Institut Albert Bonniot, Grenoble, Francia) útil para los debates.
Este trabajo fue financiado por becas del Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) (programa ATIP, PL, http://www.cnrs.fr), la Agencia Nacional Francesa de I....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones Balb/c | Janvier, Francia | Hembras de 6 semanas de edad Cepas | |
| HSV-1 Cepa | SC16 (tipo salvaje) | Véase Labetoule, M. et al. Invest. Oftalmo. Vis. Sci 44, 217– 225 (2003) para detalles sobre la cepa del VHS-1 y la preparación de la reserva de virus. | |
| Clorhidrato de ketamina | Sigma | K2753 | Inyección intraperitoneal de una solución que contiene ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) |
| Clorhidrato de xilacina | Sigma | X1251 | |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma | 158127 | Suspender 4 g de PFA en 90 ml de agua. Agregue 50 µ l de 1N NaOH, y calentar a 60 ° C en un baño de agua con agitación. El PFA se disuelve en unos 30 minutos. Agregue 10 ml de 10x PBS. Esta solución se puede preparar con anticipación y almacenar a -20 ° C en tubos de 5 ml. Cautela. Manipule debajo de una campana extractora. |
| Solución salina fisiológica | Sigma | 07982-100TAB-F | |
| 1x PBS, pH 7.4 (estéril) | Life Technologies | 10010-015 | |
| Sacarosa | Sigma | 84100 | Prepare una solución de sacarosa al 20% en 1x PBS. |
| Medio de inclusión de crioseccionamiento - Tissue-Tek OCT Compound | SAKURA | 4583 | |
| Kit de purificación de ADN de vector grande | Qiagen | 12462 | Para purificar el vector Cosmid o BAC que contiene el genoma HSV-1 y almacenarlo a -20 ° Kit |
| traducción | C Nick Roche Applied Sciences | 10 976 776 001 | |
| Cy3-dCTP | GE Healthcare | PA53021 | Proteger de la luz |
| 0.5 M EDTA | Sigma | E6758 | |
| G50 Mini columna giratoria | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| ADN de esperma de salmón 10 mg/ml | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Etanol grado de biología molecular | Sigma | 87047 | Prepare una solución al 70% |
| Esperma de salmón ADN | Invitrogen Life Technologies | 15632-011 | |
| Formamida Grado de biología molecular | Sigma | F9037 | Precaución. Manipule debajo de la campana extractora. |
| Sonda comercial biotinilada HSV-1 | Enzo Ciencias de la Vida | ENZ-40838 | |
| Bolígrafo hidrofóbico ImmEdge | Vector Laboratories | H-4000 | |
| 20x Citrato de Sodio Salino (SSC) | Sigma | S6639 | Prepare una solución de 2x SSC en ddH20. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Prepare una solución madre al 10% en agua y guárdela a +4 °C. Prepare la solución al 0,5% en 1x PBS justo antes de usar. |
| 10 mM Citrato de sodio pH 6.0 | Sigma | S1804 | Prepare una solución madre de 100 mM (10x). Pesa 10,5 g de ácido cítrico (MW 210,14). Precaución, irritante y tóxico, use mascarilla y guantes adecuados), y disolver en 400 ml de agua. Ajuste el pH a 6.0 con 1 N NaOH (precaución, irritante, use guantes). Ajustar a 500 ml con agua destilada. Diluir 10 veces en agua destilada antes de usar. |
| Ácido Acético | Sigma | 320099 | |
| Metanol, grado de biología molecular | Sigma | 322415 | |
| Sulfato de dextrano - MW 500.000 | Euromedex | EU0606-A | |
| Solución de Denhardt (100x) | Euromedex | 1020-A | |
| Cemento de caucho "FixoGum" | Marabut | 290110000 | |
| kit de purificación de ADN - Qiaquick PCR kit de purificación | Qiagen | 28104 | |
| T7 in vitro kit de transcripción | Ambion Life Technologies | AM1314 | |
| Biotina-16-UTP | Roche Ciencias Aplicadas | 11388908910 | |
| minicolumna de purificación de ARN | Qiagen | 73404 | |
| Complejo de ribonucleósido vanadilo | Nueva Inglaterra Biolabs | S1402S | |
| H2O2 | Sigma | H3410 | Prepare una solución al 3% en agua destilada. Tienda en +4 ° C y proteger de la luz. |
| Levadura tRNA | Invitrogen 15401011 | preparar una solución de 10 mg/ml en agua libre de ARNasa | |
| Suero de cabra normal | Invitrogen | PCN5000 | |
| En | la sección de resultados se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-CENP-A de ratón (mAb de conejo C51A7, Cell Signaling Technologies) y anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology) | ||
| Anticuerpos fluorescentes secundarios | Invitrogen Life Technologies | Los anticuerpos secundarios fluorescentes utilizados habitualmente en nuestro protocolo son anticuerpos de cabra marcados con Alexa Fluor (IgG H+L). El anticuerpo utilizado en la sección de resultados es un anticuerpo anti-cabra conejo labizado con Alexa Fluor 488 (referencia A11001) | |
| Kit de amplificación de señal de tiramida (TSA) - Estreptavidina + Alexa Fluor 350 (fluorescencia azul) | Invitrogen Life Technologies | #T20937 | TSA también están disponibles en el |
| kit de amplificación de señal de tiramida (TSA) de Perkin Elmer - Estreptavidina + Alexa Fluor 488 (fluorescencia verde) | Invitrogen Life Technologies | #T20932 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen Life Technologies | H3570 | Prepare un 0.5 µ g/ml de solución en 1x PBS inmediatamente antes de usar. Deseche la solución restante. |
| Cubreobjetos de 22 mm x 50 mm. n° 1.5 | ciencias de microscopía electrónica de | 72204-04 | |
| Medio de montaje con agente antidecoloración - VECASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Otro producto convencional es Fluoromount G de Electron, Microscopía Ciencia |
| , portaobjetos de vidrio Superfrost | FisherScientific | 12-550-15 | |
| Equipo/Material | Nota de referencia | de la empresa | |
| Aguja para infección | Micropipeta de vidrio estirada en caliente. Hecho a medida. | ||
| Equipo de disección | Moria, Francia | Tijeras y pinzas microquirúrgicas | |
| Bomba peristáltica | Cole Palmer Instruments | Easyload Masterflex | |
| Dispositivo de bomba de microjeringa (Nano Pump) | kdScientific | KDS310 | |
| Criostato | Leica Francia | CM 1510-1 | |
| -80 ° C congelador | Sanyo | Ultra Bajo -80 ° C | |
| Horno | |||
| Calentador de bloque seco | Eppendorf | 022670204 | |
| Portaobjetos de incubadora foso | Boekel Scientific | 240000 | |
| Coplin Jar | Dominique Dutscher | 68512 | |
| Contenedor para vidrieras | Dominique Dutscher | 68506 | |
| Microscopio fluorescente | Zeiss | resultados se recogieron con un Zeiss AxioObserver con objetivo 40X LD NeoFluor N.A 0.6, y 100X PlanApochromat N.A 1.3. Juego de filtros #38, #43 y #43. Fuente de luz fluorescente HXP 120. Cámara CCD CoolSNAP HQ2 fotométrica. La señal se observará más fácilmente en un microscopio reciente de alta eficiencia, como la serie Zeiss AxioImager/AxioObserver, la serie Ti-E/Ni-E de Nikon o la serie Leica DM/DMI6000 |
Referencias
- Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
- Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta....
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Reimpresiones y permisos
