La visualización de la sinapsis inmunológica mediante gated-Tiempo color dual Emisión Estimulada de Agotamiento (STED) Nanoscopia

Resumen

Aquí se ilustra el protocolo para obtener imágenes de dos colores STED nanoscopía la sinapsis inmune citotóxica de las células NK recapitulado sobre vidrio. Con este método se obtiene la resolución nm sub-100 de las proteínas de la sinapsis y el citoesqueleto.

Resumen

Las células asesinas naturales forman fuertemente reguladas, las sinapsis inmunológicas finamente sintonizados (SI) con el fin de lisar las células infectadas por virus o tumorigénicos. Reorganización de la actina dinámica es crítica para la función de las células NK y la formación de la SI. Imágenes de F-actina en la sinapsis ha utilizado tradicionalmente la microscopía confocal, sin embargo, el límite de difracción de la luz limita la resolución de la microscopía de fluorescencia, incluyendo confocal, a aproximadamente 200 nm. Los recientes avances en la tecnología de imágenes han permitido el desarrollo de la imagen de super-resolución limitada subdiffraction. Con el fin de visualizar la arquitectura de F-actina en el SI recapitulamos el NK citotóxica de las células de la sinapsis al adherirse las células NK para la activación del receptor en el vidrio. A continuación, las proteínas de imagen de interés usando dos colores agotamiento de la emisión estimulada de microscopía (STED). Esto da como resultado <80 nm resolución en la sinapsis. Aquí se describe los pasos de preparación de muestras y la adquisición de imágenes mediante doble colo STED nanoscopía visualizar F-actina en el NK ES. También ilustramos la optimización de la adquisición de la muestra utilizando el software SP8 Leica y el tiempo-dependientes STED. Por último, utilizamos software Huygens para el post-procesamiento de deconvolución de imágenes.

Introducción

La sinapsis inmunológica es un complejo entorno de las proteínas de señalización y elementos del citoesqueleto. La sinapsis citolítica fue originalmente descrito como teniendo un "ojo de buey" como la estructura con un anillo de actina y moléculas de adhesión que rodean un dominio secretora Central ^1-4. Sin embargo, ahora sabemos que se compone de dominios microscópicos de señalización activa que requieren continua reorganización del citoesqueleto dinámico para la función ^5-11. Mucha de la información que ahora tenemos sobre la sinapsis viene de la microscopía, y los inmunólogos han sido los primeros en adoptar la tecnología de imagen de vanguardia.

Una de estas tecnologías novela es super-resolución de la microscopía. Microscopía de luz convencional está espacialmente limitado por la barrera de la difracción de la luz, que establece el límite inferior de la resolución para todos microscopía de fluorescencia, incluyendo confocal, aproximadamente a 200 nm. En los últimos años, varias técnicas han sido developed que permiten la resolución por debajo de la barrera de la difracción. Estos incluyen la estimulación de emisión de agotamiento de microscopía (STED), microscopía iluminación estructurada (SIM), microscopía resuelto estocásticamente (TORMENTA) y microscopía de luz fotoactivable (PALM). Estas técnicas se han revisado en detalle en otra parte ^{12 a 15,} sino que se indica a continuación. Resolución limitada Subdiffraction se genera de una forma única en cada sistema. La selección de una técnica de super-resolución, por lo tanto, debe ser dictado por el experimento y el sistema experimental de interés.

Súper resolución STED se logra utilizando una alta intensidad toroidal haz agotamiento que selectivamente "silencios" de fluorescencia alrededor de cada fluoróforo de interés después de la excitación, lo que resulta en subdiffraction limitada microscopía de fluorescencia ^16-18. Una ventaja de STED es que la adquisición de imágenes es rápida y requiere relativamente poca post-procesamiento. Mientras que la selección de colorante está dictada por la especificacióntral posición del haz de agotamiento, que en el sistema comercialmente disponible se sitúa en 592 nm, varios colorantes disponibles comercialmente disponibles que hacer combinaciones de dos fluoróforos posible. Además, los reporteros fluorescentes comúnmente utilizados, tales como GFP se pueden obtener imágenes, por lo que los experimentos de células vivas posible ^19,20.

Hemos utilizado anteriormente STED para identificar y cuantificar regiones de hipodensidad F-actina que son utilizados por las células NK para la desgranulación de ^21,22. Proponemos que STED es una buena opción para obtener imágenes de la sinapsis inmune debido a su disponibilidad relativamente flexible de fluoróforos y mejora superior en una resolución en el eje xy. Además, en el sistema de STED disponibles comercialmente utilizado para estos experimentos, el uso de un escáner de resonancia de alta velocidad (12.000 Hz) permite la adquisición rápida de imágenes con un daño mínimo a las muestras. Flexibilidad limitada en la selección del tinte se considera una desventaja de STED ^12,Sin embargo dos colores STED es relativamente sencillo con varios fluoróforos disponibles en el mercado. La integración de STED con un microscopio confocal de barrido con láser también permite la formación de imágenes confocal adicional en combinación con STED, así que mientras STED se limita a dos canales, estructuras adicionales se pueden obtener imágenes en confocal con la resolución de aproximadamente 200 nm (E. Mace, observaciones no publicadas ). Mientras que se describe el uso de STED para obtener imágenes de las células inmunes, esta tecnología se aplicó a una variedad de tipos celulares, incluyendo células neuronales, y para la visualización de una variedad de estructuras celulares ^23-26.

SIM utiliza un método diferente para generar imágenes subdiffraction limitado. Mediante la visualización de patrones de excitación periódica conocidos, a continuación, la información puede obtenerse sobre la estructura desconocida en estudio después de la transformación matemática ^27. Esto produce un aumento de la resolución de ~ 100 nm lateralmente ^28,29. La ventaja de SIM es que is compatible con todos los colorantes confocal estándar y sondas, sin embargo, la desventaja es que es mucho más lento para adquirir imágenes y estos requiere un largo periodo de post-procesamiento ^12. Esto también limita su uso para imágenes de células vivas.

Por último, las imágenes de super-resolución pueden ser generados por estocástico foto conmutación de fluoróforos. Este enfoque es explotada en fotoactivado localización microscopía (PALM) y microscopía óptica reconstrucción estocástica (TORMENTA). Mediante la exploración de varios fotogramas de la cámara y la localización de moléculas activadas al azar que se activa "On" y "off" con el tiempo, las imágenes con una resolución de 20-30 nm se generan a partir de fotogramas acumulados ^30-32. El trade-off de esta resolución es el tiempo necesario para adquirir imágenes.

Aquí se muestra, en detalle, el protocolo para la preparación y muestras de imágenes de dos colores en STED. En este sistema, la excitación es con una, sintonizables, laser luz blanca pulsante. Debido a la naturalezadel haz de excitación pulsada, se hace posible gating momento de la detección y resolución de nuevos aumentos. Además, el sistema está equipado con gadolinio híbrido (HYD) detectores, que son más sensibles que los tubos fotomultiplicadores convencionales, permitiendo de este modo los requisitos de energía de láser inferiores. El haz de agotamiento para STED se aplica continuamente y está sintonizado a 592 nm, que dictará la elección de colorantes disponibles para dos colores STED. Combinaciones de colorantes más utilizados generalmente incluyen uno excitable por 488 nm (como Alexa Fluor 488, Oregon Green, DyLights verdes o Chromeo 488) y uno excitable por 458 nm (como el Pacífico o naranja Horizonte V500). Por lo tanto, mientras que la detección de los dos colorantes estará en un rango similar (y ambos son accesibles por el láser agotamiento), de excitación se produce con diferentes longitudes de onda. Con unos detectores láser sintonizables luz y sintonizables blancas, lo que maximiza la señal al tiempo que elimina la superposición espectral se hace bastante fácil. Como tal, hemos tenido buen éxito con combinationes de colorantes disponibles comercialmente, tales como Naranja Pacífico y Alexa Fluor 488 (utilizado aquí). Nuestro protocolo se adapta hacia y describe la evaluación de células NK humanas como que representa el enfoque histórico de nuestro laboratorio. Estamos utilizando específicamente la línea celular NK92 en este ejemplo, ya que es uno que hemos aplicado con regularidad en nuestra ^21,33 trabajo experimental.

Protocolo

1. Cubreobjetos capa con anticuerpos

1. Precaliente (a 37 ° C) 30 ml de RPMI 10% FCS medios y 1 ml de BD Cytofix / Cytoperm.
2. Preparar una solución de 5 g / ml de anticuerpo purificado en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para la activación de la línea celular NK92, el uso de anti-CD18 y anti-NKp30 se recomienda.
   1. Marque una moneda de diez centavos aproximadamente círculo de tamaño para cada condición en un cubreobjetos # 1.5 utilizando un lápiz PAP. Para un experimento de doble color, debe haber cuatro condiciones: no teñidas, doble manchadas, y dos condiciones de colores individuales. Dispensar 200 l de solución de anticuerpo en cada región y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
   2. Lavar cubreobjetos sumergiendo suavemente cada uno en 50 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml a temperatura ambiente. El lavado debe ocurrir inmediatamente antes de la adición de las células y se debe tener cuidado para evitar la desecación de anticuerpos en el cubreobjetos.

2. Activar las células NK en la cubiertaresbalones; Fijar y permeabilizar

1. Aislar 5 x 10 ⁵ células por NK92 condición. Centrifugar y decantar el sobrenadante. Lavar una vez con 10 ml de medio precalentado desde el paso 1.1. Centrifugar y decantar el sobrenadante.
   1. Resuspender las células en medios precalentadas desde el paso 1.1 a una concentración de 2,5 x 10 ⁶ / ml.
   2. Decantar suavemente 200 l para el centro de la región creado en la sección 1.2.1. Incubar a 37 ° C durante 20 min a 5% de CO _2. (Nota: esta vez se puede ampliar o disminuir dependiendo de la función biológica de interés para Nokia gránulo de células polarización, 20 min es suficiente.).
2. Después de la incubación de las células, lavar suavemente cubreobjetos mediante la inmersión de cada uno en 50 ml de temperatura ambiente PBS en un tubo cónico de 50 ml.
3. Añadir 1 l de Triton X-100 a 1 ml de solución de fijación / Perm precalentado desde el paso 1.1 y mezclar bien. Fijar y permeabilizar añadiendo 200 l de tampón Fix / Perm (paso 2.3) a las células. Incubar durante 10 men en la oscuridad a temperatura ambiente.

3. Las células de la mancha

1. Prepare la tinción de tampón: tampón fosfato salino (PBS), 1% de BSA, 0,1% de saponina.
   1. Preparar la solución de anticuerpo primario en 200 l tampón de tinción (véase el paso 3.1). (Nota: El anticuerpo se debe ajustar antes de su uso). Evite el uso de anticuerpo primario que se plantea en las mismas especies que se utilizan para recubrir el cubreobjetos (paso 1.2). También evite vínculos Strepatividin-biotina para imágenes STED.
   2. A raíz de la sección 2.3.1, lavar suavemente cubreobjetos en 50 ml de tinción de amortiguación. Humedezca los bordes de la región de PAP-pluma con el hisopo de algodón para eliminar el exceso de buffer. Aplique una solución de anticuerpo creado en la sección 3.1.1. Incubar 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. (Se recomienda incubar cubreobjetos en caja de portaobjetos con una toalla de papel húmeda para mantener la humedad).
2. Preparar la solución de anticuerpo secundario en 200 l tincióntampón. Fluoróforos recomendados son Alexa Fluor 488, Pacific Orange y V500. En general, una dilución de 1:200 es adecuado para formación de imágenes STED.
   1. Lave suavemente cubreobjetos en 50 ml de tinción de amortiguación. Humedezca los bordes de la región de PAP-pluma con el hisopo de algodón para eliminar el exceso de buffer. Aplicar solución de anticuerpo secundario. Incubar 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
3. Repita el lavado y la tinción de las proteínas de interés adicionales. Si la detección de F-actina con faloidina, este puede ser incluido con el anticuerpo secundario, en general, a una dilución 1:200.

4. Monte Cubreobjetos de Diapositivas

1. Preparar medio de montaje. Nota: Prolong o Prolong Oro son preferibles. VECTASHIELD debe evitarse, ya que no es compatible con STED. 2,2-thiodioethanol debe ser evitado si se utiliza faloidina. Mowiol es aceptable.
2. Coloque aproximadamente 10-20 l de medio de montaje en una diapositiva. Cubreobjetos Invertir (célula boca abajo) y montar el cubreobjetos con cuidado, teniendo cuidado deevitar la introducción de burbujas de aire. Incubar los portaobjetos durante 24 horas (cubreobjetos hacia arriba) antes de la imagen.
3. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.

5. Configuración Experimental

1. Iniciar láseres y software necesarios. Iniciar láser agotamiento STED al 100% de potencia. Alineación de haz láser STED, que en el caso de los sistemas comerciales es a menudo un procedimiento automatizado.
2. Enfoque la muestra, comenzando con solo control de colores, en el microscopio utilizando oculares.

6. Optimización de los ajustes

1. Escanear el primer canal y optimizar la potencia del láser, la posición del haz de excitación y el rango del detector. Si es posible, evitar la ganancia de> 100. Para capturar la imagen en confocal para optimizar los ajustes. Línea y / o un promedio de marco aumentarán resolución. Compruebe si hay saturación de píxel. Nota: Algunos de saturación es aceptable en confocal como aplicación de STED reducirá la intensidad de la emisión. Para STED, un tamaño óptimo pixel será inferior a 30 nm cómocada vez mejor resolución se obtiene con tamaños de píxeles más pequeños. El tamaño de la región de interés se toman las radiografías dictará el límite inferior de tamaño de píxel. Tamaños de píxeles más pequeños pueden aumentar fotoblanqueo.
   1. Aplicar la captura de imágenes STED haz agotamiento y, a partir de un 50% la potencia del láser agotamiento. Si no se observa una mejora en la resolución, mayor potencia láser agotamiento puede ser aplicada. En esta etapa, puede ser necesario para ajustar la potencia de excitación de láser, promedio de la línea, y / o ganancia.
   2. Aplicar gating tiempo para reducir el fondo (mínimo 0,3 ns). Ajuste la configuración hasta que una mejora en la resolución sobre confocal se puede ver. Resolución se puede aproximar mediante la estimación de ancho completo la mitad del máximo (FWHM). Esto representa la distancia en el medio de intensidad máxima de un pico gaussiano dibujo creado por un perfil de línea a través de la estructura de interés, y es un método ampliamente utilizado de la estimación de resolución.
   3. Una vez que el primer canal es satisfactorio, iniciar una segunda secuencia para SEincidentales o de exploración. En general, lo mejor es escanear el fluoróforo de longitud de onda más larga primero. Repita el paso 6.1 en el segundo canal.
2. Confirme la falta de superposición espectral por imágenes controles individuales teñidas con ambas secuencias de escaneado. Superposición espectral leve se puede corregir utilizando características espectrales de la ONU-la mezcla en el software, sin embargo debe evitarse siempre que sea posible.

7. Adquisición de imágenes

1. Adquirir imágenes. Para cuantitativo de imágenes, se recomienda para obtener al menos 20 imágenes / condiciones. El número exacto, sin embargo, debe ser definido de acuerdo con la pregunta experimental en concierto con un enfoque estadístico, como el cálculo del tamaño de muestra. Ahorra experimento.

8. Deconvolution

1. Abrir el archivo con el software de deconvolución o procesador por lotes. Compruebe los parámetros para cada canal mediante software. Confirme los espectros de excitación y emisión de cada canal, STED emisión agotamiento, y dirección de imágenesción (hacia arriba o hacia abajo, si la imagen es de 3 dimensiones), en particular.
2. Deconvoluir mediante el asistente de deconvolución. Los ajustes por defecto son generalmente adecuados, sin embargo la relación señal-ruido (SNTR) variará de un fluoróforo al fluoróforo y tendrá que ser determinado para cada canal y cada experimento individual.

Resultados

Está claro que el objetivo principal de las imágenes de super-resolución será una mejora con respecto a la microscopía confocal convencional. Sin embargo, hay algunos errores comunes que pueden conducir a la resolución óptima. Esto requiere que cada experimento optimizarse individualmente. En nuestro experimento representativo, estamos Imaging la red F-actina en una célula NK activadas por el anticuerpo unido al vidrio. Las causas comunes de (y correcciones para) la falta de resolución mejorada de STED sobre confocal son los siguientes:

1. Sub-muestreo (Figura 1a). Esto puede conducir a la granularidad y la pérdida de información de los píxeles, como se muestra por la mala resolución de los filamentos de F-actina. El aumento de la línea o un promedio de marco a menudo pueden corregir esto.
2. Blanqueo y / o sobre-muestreo (Figura 1b). Esto puede ser causado por píxel largo tiempo de permanencia como resultado de la excesiva de la línea de promediado. Alternativamente, puede ser un resultado de la exploración sobre-de la imagen antes de la adquisición, incluyendo el uso excesivo deel láser agotamiento. Esto se traduce comúnmente en las imágenes confusas o difusas. Esto se puede corregir mediante el escaneo de la campo de interés sólo mínimamente antes de adquirir o, si es posible, aumentar la velocidad de exploración láser. Si el problema persiste, la potencia del láser agotamiento puede ser reducido.

Al lograr el equilibrio correcto de tiempo de permanencia de píxeles, la potencia del láser de excitación, y la potencia del láser agotamiento, una imagen con una mejor resolución y la información que pueda generarse suficiente (Figura 1c). Resolución se puede mejorar aún más por el uso de deconvolución (Figura 1d). Cuando se optimiza la adquisición, deconvolución mejorará la resolución, tanto cualitativa como cuantitativamente, y debajo de los 100 nm de resolución debe ser evaluada alcanzable.

Figura 1. Optimización de la adquisición y errores comunes de imágenes STED. NK92 células se activaron el anti-CD18 y NKp30 vidrio recubierta durante 20 minutos después se fijaron, permeabilizaron y se tiñeron para F-actina con faloidina Alexa Fluor 488. A) Un ejemplo de pérdida de información de imagen debido a. b submuestreo) Un ejemplo de la pérdida de resolución debido al blanqueamiento / sobremuestreo c) las condiciones d optimizado) condiciones optimizadas conducen a una mayor mejora en la resolución de deconvolución. Barra de escala = 5 micras.

Discusión

La mejora en la resolución sobre confocal será algo que depende de factores que no pueden ser controlados. Estos factores incluyen aberraciones menores de espesor de hoja de la cubierta y de las inconsistencias en los medios de montaje. Es importante mantener la temperatura y la humedad en la sala de proyección de imagen lo más coherente posible, y el haz de STED debe ser realineado aproximadamente cada 60 min. Como se mencionó en los procedimientos, el uso de medio de montaje VECTASHIELD se debe evitar, ya que no es compatible con STED. Además de que, se debe utilizar siempre # 1.5 cubreobjetos, y si está disponible, utilice las que se han verificado hasta un grosor específico.

Una modificación del método descrito aquí es a imagen canales adicionales en confocal, usando fluoróforos que emiten a una longitud de onda más largo que el haz de STED. De esta manera, una imagen puede hasta cuatro canales (dos en confocal, dos en STED). Si toma este enfoque, sin embargo, los canales con fluoróforos enecesitará mitting encima del láser agotamiento STED a ser fotografiado primera, como la aplicación del haz de STED agotará fotones en estos canales. Una ventaja de esta técnica es la aplicación de compuerta tiempo, que también mejorar la resolución en confocal mediante la eliminación de las emisiones de fotones con tiempos de vida cortos ^34. En particular, el uso de compuerta tiempo, el momento de detectores de emisión para corresponder con excitación pulsada STED, disminuirá la fluorescencia de fondo de la reflexión de vidrio cubreobjetos cuando formación de imágenes cerca de ella. Incluso en un experimento no es adecuado para STED, si se utiliza una fuente de excitación pulsada, el bloquear el tiempo puede ser una herramienta útil para mejorar la resolución en confocal.

Hay diversas modificaciones que pueden ser utilizados para mejorar la resolución en STED. Una de ellas es para disminuir el tamaño del agujero de alfiler de la unidad 1 de Airy estándar, aunque esto también disminuirá la cantidad de luz que llega a la muestra. Esto puede ser compensado mediante el aumento de laspoder er o ganancia. Otra es la de aumentar la media de la línea, lo que aumentará la cantidad de información recopilada por cada fotón, la mejora de resolución. Una vez más, sin embargo, esto puede ser a costa de photobleaching de la muestra, por lo que se necesita un equilibrio necesario entre la resolución y el blanqueo. Del mismo modo, el uso de proteínas fluorescentes, tales como GFP requerirá la optimización cuidadosa para evitar la decoloración. Esto se puede lograr por la disminución de la potencia del láser STED si es necesario. Puntos de tiempo más largos también permitirán una mayor recuperación de fotones y reducir la decoloración. Corrección por fotoblanqueo debe contabilizarse al analizar STED vivo.

Por supuesto, de formación de imágenes en 3 dimensiones en STED también es posible, y también dará una mejora sobre la imagen confocal convencional. Esto es particularmente cierto si se hace en combinación con deconvolución, aunque se debe tener cuidado para corregir la deriva que se produce durante la formación de imágenes múltiples planos en el eje z. Si el uso de software de Huygensa deconvoluir, se obtiene esta corrección utilizando la función de "estabilizar la imagen." Usando este enfoque, se puede mejorar la resolución en el eje z. Esta es una gran mejora con respecto a la imagen confocal convencional, que tiene una pobre resolución axial, e incluso más de sólo Sted en sí, que también tiene relativamente pobre resolución eje z. Si bien la adquisición de varias pilas en STED, se debe tener cuidado para evitar el blanqueo de la muestra, y si uno es necesario puede reducir un promedio de línea o la intensidad de potencia del láser con el fin de hacerlo. Una vez más, hay que señalar que si otros fluoróforos formación de imágenes que no son adecuados para STED, la aplicación del haz de agotamiento en la primera exploración secuencial sería evitar la emisión de estos canales. Por lo tanto, un enfoque STED / confocal mixta (cuando se utiliza confocal de barrido en canales que emiten en una longitud de onda mayor que 592 nm) será por desgracia no ser adecuado para 3D.

En resumen, hemos elegido STED como un acercamiento debido a su relativa facilidad de aplicacióncación y la mejora en la resolución sobre la imagen confocal estándar. Para obtener imágenes de la sinapsis inmune, se ha demostrado una técnica eficaz y valioso que nos permite ver los detalles de la arquitectura no es posible la actina F con una resolución de más de 200 nm. Mientras que muchos de estos detalles parecer sutiles, que pueden tener un profundo efecto sobre la función de las células NK. Por lo tanto, estamos aplicando la última tecnología de imagen nanoscópico para derivar información que es fundamental para el mantenimiento de la salud humana.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
#1.5 cubreobjetos	VWR	48393-172
BD Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences	554722
Albúmina sérica bovina	Sigma	A2153
Aplicador con punta de algodón	Fisher Scientific	S450941
Falcon tubos centrífugos (50 ml)	VWR	352070
Suero fetal de ternera (FCS) (500 ml)	Atlantic Biologicals	S11050
Cabra anti-conejo Pacific Orange	Life Technologies	P31584
Limpiadores de pañuelos de laboratorio	VWR	82003-820
Esmalte de uñas	VWR	100491-940
Celdas NK-92	ATCC	CRL-2407
Faloidina Alexa Fluor 488	Life Technologies	A12379
Solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies 14190250
Reactivo antidecoloración Prolong	Life Technologies	P7481
Anti-CD18 purificado	Biolegend	301202
Anti-NKp30 purificado	Biolegend	325202
Antiperforina purificada	Biolegend	308102
RPMI 1640 medio ( 500 ml)	Life Technologies	11875-093
Saponina de corteza de Quillaja	Bolígrafo Sigma	S4521
Super PAP	Life Technologies	008899
Triton X-100	Ciencias de la Microscopía Electrónica	22142
Huygens software de deconvolución	SVI	Contactar empresa
Leica Microscopio TCS STED Leica	Empresa		de contacto