Mediciones de videomicroscopía intravital del flujo sanguíneo de la retina en ratones

Resumen

La microscopía intravital se puede utilizar en animales para visualizar y medir los diámetros vasculares de la retina, las velocidades del torrente sanguíneo y el flujo sanguíneo total de la retina.

Resumen

Las alteraciones en el flujo sanguíneo de la retina pueden contribuir a, o ser consecuencia de, la enfermedad ocular y la disfunción visual. Por lo tanto, la cuantificación de la perfusión alterada puede ayudar a la investigación de los mecanismos de las patologías de la retina. La videomicroscopía intravital de trazadores fluorescentes se puede utilizar para medir los diámetros vasculares y las velocidades del torrente sanguíneo de la vasculatura de la retina, específicamente de las arteriolas que se ramifican desde la arteria central de la retina y de las vénulas que conducen a la vena central de la retina. Las tasas de flujo sanguíneo se pueden calcular a partir de los diámetros y las velocidades, con la suma del flujo arteriolar y el flujo venular por separado, proporcionando valores del flujo sanguíneo total de la retina. Este artículo y el video asociado describen los métodos para aplicar esta técnica a ratones, que incluyen 1) la preparación del ojo para la microscopía intravital del animal anestesiado, 2) la infusión intravenosa de microesferas fluorescentes para medir la velocidad del torrente sanguíneo, 3) la infusión intravenosa de un dextrano fluorescente de alto peso molecular, para ayudar a la visualización microscópica de la microvasculatura de la retina, 4) el uso de una cámara microscópica digital para obtener videos de la retina perfundida, y 5) el uso de software de procesamiento de imágenes para analizar el video. Las mismas técnicas se pueden utilizar para medir las tasas de flujo sanguíneo de la retina en ratas.

Introducción

La retina es uno de los tejidos metabólicamente más activos del cuerpo y, en consecuencia, requiere un generoso suministro de sangre. Dos circulaciones separadas satisfacen esta demanda: la circulación coroidea para la porción externa de la retina y la circulación retiniana para la porción interna de la retina. Las investigaciones de la perfusión retiniana son imprescindibles para comprender los mecanismos patológicos y las consecuencias de la retinopatía diabética, la retinopatía inducida por oxígeno, la oclusión de arterias o venas retinianas y el accidente cerebrovascular. Se han empleado varios métodos para cuantificar el flujo sanguíneo de la retina, y cada técnica tiene sus ventajas, desventajas, limitaciones y suposiciones. Entre estas técnicas se encuentran la infusión de microesferas de 7-8 μm de diámetro que se alojan en las arteriolas precapilares^1,2, la autorradiografía cuantitativa^3,4, la microangiopatía óptica-tomografía de coherencia óptica^5,6, la resonancia magnética^7,8 y la videomicroscopía intravital^9-16. Las ventajas de este último incluyen la visualización directa en vivo de los vasos y el flujo de la retina, la dependencia de solo unas pocas suposiciones menores y la asequibilidad para los laboratorios que tienen un microscopio de fluorescencia con una cámara de video conectada. En estudios previos de videomicroscopía intravital^9-16, el dextrano fluorescente se ha utilizado como marcador plasmático, y los glóbulos rojos marcados con fluorescencia (de un animal donante) se han utilizado como marcadores de velocidad. En el protocolo actual, se utilizan microesferas marcadas con fluorescencia de 1,9 μm de diámetro, en lugar de glóbulos rojos, para medir la velocidad, y esta alteración elimina la necesidad de un donante de células sanguíneas.

Protocolo

Los procedimientos que involucran el uso de animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de LSUHSC-S y realizados de acuerdo con los criterios descritos por los Institutos Nacionales de Salud.

1. Preparación de soluciones de perfusión

1. Sonicar una solución madre al 1% (en peso) de microesferas de 1,9 μm de diámetro.
2. Extraiga ~ 25-30 x 10⁶ microesferas fluorescentes verdes (es decir, ~ 10 μl de la solución madre) en una jeringa de 300 μl. Diluya las microesferas retirando 240 μl adicionales de solución salina en la jeringa.
3. Prepare una solución de 50 μl de dextrano fluorescente de peso molecular 2 x 10⁶ disuelto en solución salina estéril, con la dosis inyectada en el rango de 3-10 mg/kg. Mantenga el dextrano cubierto con papel de aluminio hasta el momento de su infusión.

2. Anestesia Animal y Canulación Vascular

1. Anestesiar al animal para la inserción quirúrgica de cánulas vasculares y para su posicionamiento estacionario bajo un objetivo de microscopio. Existen muchas opciones de protocolos anestésicos, con diversas ventajas y desventajas, y efectos potenciales sobre los parámetros sistémicos. Entre las muchas opciones diferentes se encuentran una combinación de ketamina (100-150 mg/kg), xilacina (10 mg/kg) y acepromazina (2 mg/kg), o una combinación de ketamina (50 mg/kg) y pentobarbital (50 mg/kg). Los procedimientos descritos son agudos y concluyen con eutanasia inducida por una sobredosis de pentobarbital (150 mg/kg) seguida de una toracotomía; La inclusión de un analgésico no es necesaria para el procedimiento terminal.
2. Mantenga una almohadilla térmica debajo del animal durante el resto del experimento.
3. Mantenga los ojos húmedos con solución salina tamponada con fosfato durante las inserciones quirúrgicas posteriores de las cánulas vasculares.
4. Preparar una cánula vascular para las infusiones posteriores de trazadores fluorescentes. En la punta de una aguja de jeringa se coloca un tubo de polietileno de 20 cm de longitud (por ejemplo, 0,28 mm de diámetro interior; 0,61 mm de diámetro exterior), con el extremo afilado de la aguja roto previamente doblándolo hacia adelante y hacia atrás con un hemostático.
5. Llene una jeringa y un tubo con solución salina heparinizada (25 U/ml).
6. Afeita un lado de la parte inferior del abdomen y haz una incisión para exponer la vena femoral.
7. Para canular la vena femoral, ate el vaso con una sutura 5.0, haga una incisión parcial del vaso (aproximadamente la mitad del diámetro del vaso) e inserte el tubo en el vaso, asegurando el tubo con la sutura atada alrededor de la sección canulada.

3. Preparación para la microscopía intravital

1. Dilatar la pupila del ojo con una gota de solución oftálmica de tropicamida al 1% seguida de una gota de solución oftálmica de hipromelosa al 2,5%.
2. Cubra el ojo con un cubreobjetos de vidrio de 5 mm.
3. Coloque al animal en un tablero de plexiglás, que se colocará debajo del objetivo del microscopio de un microscopio vertical. Coloque estratégicamente la gasa quirúrgica debajo de la cabeza para permitir un eje directo a través del objetivo hasta la retina central y el disco óptico.
4. Enfoque a través del microscopio en el disco óptico, encontrando el disco con un objetivo 4X de baja potencia y usando un filtro de fluoresceína.

4. Infusión de microesferas fluorescentes para medir velocidades

1. Usando un objetivo 4X, concéntrese en la retina con el disco óptico en el centro del campo de visión.
2. Infundir la solución de microesferas fluorescentes a una velocidad de 250 μl/min/kg.
3. Grabe en video la retina visible alrededor del disco óptico, utilizando un tiempo de exposición de la cámara de ~ 8 mseg.
4. Detenga la infusión de microesferas cuando se haya grabado una duración suficiente de video (1-2 min); es probable que alguna solución de microesferas permanezca sin usar.

5. Infusión de un marcador de plasma fluorescente para medir diámetros

1. Usando un objetivo 4X, concéntrese en la retina con el disco óptico en el centro del campo de visión.
2. Infundir la solución preparada de dextrano fluorescente en la vena femoral como un bolo durante ~ 5 segundos, mientras graba el video. Este video ayudará a determinar la identidad de las arteriolas frente a las vénulas, y primero se perfundirán las arteriolas. Realice este paso con el tiempo de exposición de la cámara establecido en ~8 mseg, aunque el tiempo de exposición preciso no es crítico.
3. Cambie a un objetivo de 10X y un tiempo de exposición de 20-40 mseg para mejorar la resolución y grabar en video cada una de las 4-7 arteriolas y 4-7 vénulas en la retina superficial. Enfoque (y grabe en vídeo) aproximadamente un cuadrante de la retina visible a la vez, con el centro del disco óptico en una esquina del campo de visión. Se debe intentar minimizar el tiempo que la luz del microscopio ilumina el tejido para reducir la posibilidad de fototoxicidad inducida por la luz/colorante¹⁷.

6. Análisis de video

1. Con una escala micrométrica, calibre el sistema de vídeo para obtener una conversión de μm/píxel.
2. Con el software de procesamiento de imágenes, reproduzca el video grabado.
3. A partir del video de la infusión en bolo de dextrano fluorescente, identifique las arteriolas frente a las vénulas.
4. Para cada una de las 4-7 arteriolas y 4-7 vénulas registradas con el objetivo 10X, se midan los diámetros llenos de dextrano fluorescente, con un promedio de 5 medidas de diámetro por vaso a lo largo de la longitud visible.
5. Para cada una de las mismas arteriolas y vénulas, se mida la longitud de las microesferas fluorescentes, utilizando 10 estrías de microesferas sucesivas en cada vaso para evitar el sesgo de selección. Divida las longitudes de las rayas por el tiempo de exposición para calcular la velocidad de la microesfera, por ejemplo, 160 μm/8 mseg = 20 μm/mseg = 2 cm/seg. Promedie las 10 velocidades por embarcación.
6. Calcule el caudal volumétrico para cada recipiente con la siguiente ecuación: flujo = velocidad media × π × diámetro²/4.
7. Suma las tasas de flujo arteriolar, y por separado las tasas de flujo venular, para obtener el flujo sanguíneo total de la retina.

Resultados

Figura 1 muestra cuadros individuales de un video procedente de un experimento, con los paneles A-D y F-I que muestran trazos de microesferas fluorescentes capturados con un objetivo de 4X y un tiempo de exposición de 8 ms (y agrupación de píxeles 2 x 2 para reducir el tamaño del archivo de video). Figura 1E muestra la orientación de los vasos retinianos en los otros paneles de la figura. No todos los cuadros del video tendrán un trazo fluorescente enfocado; sin embargo, alguno...

Discusión

Esta técnica de videomicroscopía intravital se puede aplicar no solo a ratones, sino también a ratas. Este protocolo se basa solo en varios supuestos, pero se limita a su uso bajo anestesia y con dilatación de la pupila como lo hemos descrito. Los otros supuestos y limitaciones son los siguientes:

1. Suposición de un error de aumento óptico mínimo resultante de la naturaleza refractiva del ojo. Como lo describen otros^18-20, el método de llenar el espacio entre la cór...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microesferas fluorescentes	Bangs Laboratories	FS04F/10584 (verde)
Sondas moleculares	fluorescentes de dextrano de alto peso molecular	D-7137 (verde); D-7139 (rojo)
Sistema de microscopio	Nikon	Eclipse E600FN + accesorios objetivo
4X	Nikon	Plan Fluor 4X	apertura numérica 0,13; distancia de trabajo 17,2 mm
10X	Nikon	Plan 10X	apertura numérica 0,25; distancia de
trabajo 10,5 mm Tropicamida solución oftálmica Bausch Lomb 1% TropicamidaSolución oftálmica de hipromelosa	HUB Pharmaceuticals	2.5% Goniovisc
Software de procesamiento de imágenes	Universidad de California San Francisco Vale Lab	Micro-Manager
Cámara de video digital para microscopía	Fotometría	CoolSnap ES	1392 x 1040 pixel resolución; tamaño de píxel 6,45 x 6,45 μ m

objetivo