Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Summary

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Abstract

Los cardiomiocitos de corazones enfermos son sometidos a procesos de remodelación de complejos que implican cambios en la estructura celular, contracción de acoplamiento excitación y corrientes iónicas de membrana. Esos cambios son probable que sea responsable del aumento del riesgo arritmogénica y las alteraciones contráctiles conducen a la disfunción sistólica y diastólica en pacientes cardíacos. Sin embargo, más información sobre las alteraciones de la función de los miocitos en enfermedades cardíacas ha llegado a partir de modelos animales.

Aquí describimos y validar un protocolo para aislar miocitos viables desde pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular de los pacientes sometidos a operaciones de cirugía cardiaca. El protocolo se describe en detalle. Mediciones electrofisiológicas y de calcio intracelulares se presentan para demostrar la viabilidad de un número de mediciones de células individuales en cardiomiocitos ventriculares humanos obtenidos con este método.

El protocolo informó élre pueden ser útiles para futuras investigaciones sobre las bases celulares y moleculares de las alteraciones funcionales del corazón humano en la presencia de diferentes enfermedades cardiacas. Además, este método puede ser usado para identificar nuevas dianas terapéuticas a nivel celular y para probar la eficacia de nuevos compuestos en cardiomiocitos humanos, con valor de traslación directa.

Introduction

La disección de las propiedades electrofisiológicas del miocardio ha progresado notablemente después el desarrollo de técnicas para el solo aislamiento de miocitos cardiacos. También se han hecho posible los avances recientes en la comprensión de la excitación cardíaca contracción de acoplamiento (EC-Acoplamiento) por la capacidad de aislar los cardiomiocitos viables individuales que conservan todas las propiedades fisiológicas del tejido intacto. Métodos de fijación Patch se emplean rutinariamente para estudiar la función y la modulación farmacológica de las corrientes de iones sarcolema cardíaco. Grabaciones de la dinámica del calcio intracelular con Ca ^{2 +}

Protocol

Los protocolos experimentales sobre el tejido humano fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Careggi Hospital (2006/0024713; renovada mayo de 2009). Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito.

1. Soluciones y Preparación del equipo

Las soluciones se describen en la Tabla 1. Un diagrama de flujo simplificado del procedimiento de aislamiento de células se encuentra en la Figura 1.

Solución

CP

DB

KB

Tuberculosis

PS <....

Results

Se empleó el método descrito anteriormente para caracterizar las anormalidades funcionales de cardiomiocitos aislados del tabique interventricular de pacientes con miocardiopatía hipertrófica (MCH) que se sometieron a la operación miectomía, en comparación con los pacientes no quirúrgicos que fallan no hipertróficas ^21. Los resultados que figuran en esta sección se derivan de que el trabajo ²¹ y se muestra aquí como un ejemplo de cómo esta técnica se puede utilizar para caracterizar las alteracione.......

Discussion

Hemos descrito y validado un método para aislar miocitos viables a partir de muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. A partir de los protocolos descritos anteriormente que había sido utilizado con éxito para células aisladas a partir de muestras quirúrgicas auriculares, la técnica para permitir la separación de los miocitos viables individuales de miocardio ventricular enferma fue desarrollado y afinado. Los primeros informes mostraron que el aislamiento de los cardiomiocitos individuales de trozos de teji.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Sulfato de magnesio heptahidratado(MgSO4*7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosina	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich<	a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it& region=IT">M4125
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625
Hidróxido de potasio (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Cloruro de potasio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Bicarbonato de potasio (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Pyruvato de sodio	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanediona monoxima	Sigma-Aldrich	B0753
Hidróxido de sodio(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Ácido glutámico sal monopotásica monohidrato	Sigma-Aldrich	49601
Ácido pirúvico	Sigma-Aldrich	107360
3-Ácido hidroxibutírico	Sigma-Aldrich	166898
Adenosina 5′-trifosfato dipotásico sal dipotásica dihidratada (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatina	Sigma-Aldrich	C0780
Ácido succínico	Sigma-Aldrich	S3674
Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albúmina de suero bovino	Sigma-Aldrich	A0281
Cloruro de magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Colagenasa de Clostridium histolyticum, Tipo V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinasa, Bacteriana, Tipo XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Solución de cloruro de calcio, ~1 M en H2O	Sigma-Aldrich	21115
Solución de cloruro de calcio 0,1 M	Sigma-Aldrich	53704
Metanosulfonato de potasio	Sigma-Aldrich	83000
Reactivo FluoForte	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Concentrado de carga de potencia, 100X	Life Technologies	P10020
Sistema de perfusión de paso rápido	Warner Instruments	VC-77SP
Anfotericina B solubilizada	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B amplificador patch-clamp	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	El
	se		fabrica a medida en nuestro laboratorio utilizando tubos de plástico, Sylgard fundido y un motor; se describe en detalle en la Figura 1C-1D y en la Figura 7. Podemos proporcionar más detalles si lo solicita.
Elastómero de silicona para los cepillos del dispositivo de digestión	Dow Corning	SYLGARD® 184
Motor giratorio de velocidad variable para el dispositivo de digestión	Crouzet	Crouzet 178-4765
Molde para cepillos de fundición	N.A.	N.D.	El molde está hecho a medida a partir de varillas estándar de PTFE de 2,5 cm de diámetro.