Artículo de método
Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.
Los cardiomiocitos de corazones enfermos son sometidos a procesos de remodelación de complejos que implican cambios en la estructura celular, contracción de acoplamiento excitación y corrientes iónicas de membrana. Esos cambios son probable que sea responsable del aumento del riesgo arritmogénica y las alteraciones contráctiles conducen a la disfunción sistólica y diastólica en pacientes cardíacos. Sin embargo, más información sobre las alteraciones de la función de los miocitos en enfermedades cardíacas ha llegado a partir de modelos animales.
Aquí describimos y validar un protocolo para aislar miocitos viables desde pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular de los pacientes sometidos a operaciones de cirugía cardiaca. El protocolo se describe en detalle. Mediciones electrofisiológicas y de calcio intracelulares se presentan para demostrar la viabilidad de un número de mediciones de células individuales en cardiomiocitos ventriculares humanos obtenidos con este método.
El protocolo informó élre pueden ser útiles para futuras investigaciones sobre las bases celulares y moleculares de las alteraciones funcionales del corazón humano en la presencia de diferentes enfermedades cardiacas. Además, este método puede ser usado para identificar nuevas dianas terapéuticas a nivel celular y para probar la eficacia de nuevos compuestos en cardiomiocitos humanos, con valor de traslación directa.
La disección de las propiedades electrofisiológicas del miocardio ha progresado notablemente después el desarrollo de técnicas para el solo aislamiento de miocitos cardiacos. También se han hecho posible los avances recientes en la comprensión de la excitación cardíaca contracción de acoplamiento (EC-Acoplamiento) por la capacidad de aislar los cardiomiocitos viables individuales que conservan todas las propiedades fisiológicas del tejido intacto. Métodos de fijación Patch se emplean rutinariamente para estudiar la función y la modulación farmacológica de las corrientes de iones sarcolema cardíaco. Grabaciones de la dinámica del calcio intracelular con Ca 2 +
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Los protocolos experimentales sobre el tejido humano fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Careggi Hospital (2006/0024713; renovada mayo de 2009). Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito.
1. Soluciones y Preparación del equipo
Las soluciones se describen en la Tabla 1. Un diagrama de flujo simplificado del procedimiento de aislamiento de células se encuentra en la Figura 1.
| Solución | CP | DB | KB | Tuberculosis | PS <.... | |
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Se empleó el método descrito anteriormente para caracterizar las anormalidades funcionales de cardiomiocitos aislados del tabique interventricular de pacientes con miocardiopatía hipertrófica (MCH) que se sometieron a la operación miectomía, en comparación con los pacientes no quirúrgicos que fallan no hipertróficas 21. Los resultados que figuran en esta sección se derivan de que el trabajo 21 y se muestra aquí como un ejemplo de cómo esta técnica se puede utilizar para caracterizar las alteracione.......
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Hemos descrito y validado un método para aislar miocitos viables a partir de muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. A partir de los protocolos descritos anteriormente que había sido utilizado con éxito para células aisladas a partir de muestras quirúrgicas auriculares, la técnica para permitir la separación de los miocitos viables individuales de miocardio ventricular enferma fue desarrollado y afinado. Los primeros informes mostraron que el aislamiento de los cardiomiocitos individuales de trozos de teji.......
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Este trabajo fue apoyado por la Unión Europea (PEIF Proyecto 241577 "gran corazón", 7 º Programa Marco Europeo, CP), Menarini Internacional Luxemburgo Operaciones (AM), Teletón GGP07133 (CP) y Gilead Sciences (AM).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Sulfato de magnesio heptahidratado(MgSO4*7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosina | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich< | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it& region=IT">M4125 | |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hidróxido de potasio (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Bicarbonato de potasio (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Pyruvato de sodio | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanediona monoxima | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Hidróxido de sodio(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Ácido glutámico sal monopotásica monohidrato | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Ácido pirúvico | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Ácido hidroxibutírico | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosina 5′-trifosfato dipotásico sal dipotásica dihidratada (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatina | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Ácido succínico | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetraacético (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albúmina de suero bovino | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Cloruro de magnesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum, Tipo V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinasa, Bacteriana, Tipo XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Solución de cloruro de calcio, ~1 M en H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Solución de cloruro de calcio 0,1 M | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Metanosulfonato de potasio | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| Reactivo FluoForte | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Concentrado de carga de potencia, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Sistema de perfusión de paso rápido | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Anfotericina B solubilizada | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B amplificador patch-clamp | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | El | ||
| se | fabrica a medida en nuestro laboratorio utilizando tubos de plástico, Sylgard fundido y un motor; se describe en detalle en la Figura 1C-1D y en la Figura 7. Podemos proporcionar más detalles si lo solicita. | ||
| Elastómero de silicona para los cepillos del dispositivo de digestión | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Motor giratorio de velocidad variable para el dispositivo de digestión | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Molde para cepillos de fundición | N.A. | N.D. | El molde está hecho a medida a partir de varillas estándar de PTFE de 2,5 cm de diámetro. |
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