Este protocolo describe cómo diseccionar la cresta neural craneal premigratorio (NC) de neurulas Xenopus laevis. Estos explantes se pueden sembrar en fibronectina y cultivadas in vitro, o injertados en embriones de acogida. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos de la NC transición epitelio-mesénquima, la migración y la diferenciación.
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En este artículo
Resumen
Resumen
La cresta neural (NC) es una población de células dorsal del tubo neural transitoria que sufre una transición epitelio-mesénquima (EMT) al final de la neurulación, migra ampliamente hacia diversos órganos, y se diferencia en muchos tipos de derivados (neuronas, neuroglia, cartílago y hueso, células pigmentadas y endocrinos). En este protocolo, se describe la forma de diseccionar la premigratorio craneal NC a partir de embriones de Xenopus laevis, con el fin de estudiar el desarrollo de NC in vivo e in vitro. El modelo de la rana ofrece muchas ventajas para estudiar el desarrollo temprano; abundantes lotes están disponibles, los embriones se desarrollan rápidamente, ganancia in vivo y la pérdida de las estrategias de función permiten la manipulación de la expresión génica antes de la disección NC en donante y / o embriones de acogida. Los explantes de NC se pueden sembrar en fibronectina y utilizados para estudios in vitro. Ellos pueden cultivarse durante varios días en un medio definido libre de suero. También describe cómo injertar explantes NC espaldaen embriones de acogida para el estudio de NC migración y diferenciación in vivo.
Introducción
La cresta neural (NC) es una población de células embrionarias transitoria que emerge del tubo neural en el extremo del tubo neural en embriones de vertebrados. Los eventos de señalización y genéticos que controlan la especificación NC comenzar tan pronto como la gastrulación. La NC se especifica en la frontera entre el ectodermo neural y no neural por las señales de los tejidos que rodean dorsales. Al final de la neurulación, NC células se someten a una transición epitelio-mesénquima (EMT) y migran extensamente en el embrión siguientes rutas estereotipadas de responder a las señales de guía circundante. Una vez que han llegado a su destino final, se diferencian en u....
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Protocolo
Los experimentos cumplen con la reglamentación nacional y europea relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento.
1. Preparación de platos recubiertos con fibronectina 14
- Pipetear 500 ml de 10 mg / ml de fibronectina de grado cultivo diluido en 1x tampón fosfato salino (PBS) en una placa de Petri estándar de plástico (Ø 40 x 11 mm). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Nota: si usa platos de cristal o cubreobjetos de vidrio para la imagen posterior, utilice una solución de fibronectina 100 mg / ml.....
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Resultados
Cuando chapada en fibronectina, los explantes de la cresta neural se adhieren rápidamente (15-30 min) y el explante se extiende plana dentro de 2 horas (Figura 1A). Después de 3-6 células hr comienzan a dispersarse. En 24 horas a 15 ° C, muchas células han comenzado a migrar fuera del explante (figuras 1B y 1C). Yema hace que las células muy brillante bajo contraste de fase (Figura 1B). Protuberancias celulares (filopodes y lamellipodes) son claramente .......
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Discusión
Este protocolo describe una técnica fácil de explante premigratorio craneal NC en embriones de X. laevis. Los embriones utilizados para dichos experimentos deben ser robustos y sanar bien. Deseche cualquier lote de embriones saludables. Además, crecer los embriones a diferentes temperaturas (de 12 a 18-20 ° C), con el fin de escindir la cresta neural en la etapa 17 y no más tarde. Después de la etapa 17, la cresta neural se puede mezclar con mesodermo cefálico y no se puede eliminar completamente. Tejidos d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Adeline Dolly por las fotos de explante de fibronectina, Eric Theveneau útil para los debates y el Fondo para los Animales del Instituto Curie. CM es un becario postdoctoral de la Región Ile de France (Domaine d'Interet Majeur vástago Pole), Université Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche) y la Agence Nationale de la Recherche. Este trabajo fue financiado por la Universite Paris Sud (Attractivite 2011), el Centre National de la Recherche Scientifique (Programa de Acción Thematique et incitativo sur), la Asociación pour la Recherche contre le cáncer de Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cáncer, y la Agence Nat....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Fibronectina de plasma bovino | Sigma | F4759-1MG | |
| Albúmina sérica bovina, fracción V | Euromedex | 04-100-811-C | El grado de calidad inferior puede ser adecuado para esta aplicación |
| Alfileres de insectos de acero inoxidable, tamaño 000 | FST | 26001 | |
| Pinza Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm | FST | 11252-20 |
Referencias
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to....
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Reimpresiones y permisos
