La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

Resumen

Este protocolo describe cómo diseccionar la cresta neural craneal premigratorio (NC) de neurulas Xenopus laevis. Estos explantes se pueden sembrar en fibronectina y cultivadas in vitro, o injertados en embriones de acogida. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos de la NC transición epitelio-mesénquima, la migración y la diferenciación.

Resumen

La cresta neural (NC) es una población de células dorsal del tubo neural transitoria que sufre una transición epitelio-mesénquima (EMT) al final de la neurulación, migra ampliamente hacia diversos órganos, y se diferencia en muchos tipos de derivados (neuronas, neuroglia, cartílago y hueso, células pigmentadas y endocrinos). En este protocolo, se describe la forma de diseccionar la premigratorio craneal NC a partir de embriones de Xenopus laevis, con el fin de estudiar el desarrollo de NC in vivo e in vitro. El modelo de la rana ofrece muchas ventajas para estudiar el desarrollo temprano; abundantes lotes están disponibles, los embriones se desarrollan rápidamente, ganancia in vivo y la pérdida de las estrategias de función permiten la manipulación de la expresión génica antes de la disección NC en donante y / o embriones de acogida. Los explantes de NC se pueden sembrar en fibronectina y utilizados para estudios in vitro. Ellos pueden cultivarse durante varios días en un medio definido libre de suero. También describe cómo injertar explantes NC espaldaen embriones de acogida para el estudio de NC migración y diferenciación in vivo.

Introducción

La cresta neural (NC) es una población de células embrionarias transitoria que emerge del tubo neural en el extremo del tubo neural en embriones de vertebrados. Los eventos de señalización y genéticos que controlan la especificación NC comenzar tan pronto como la gastrulación. La NC se especifica en la frontera entre el ectodermo neural y no neural por las señales de los tejidos que rodean dorsales. Al final de la neurulación, NC células se someten a una transición epitelio-mesénquima (EMT) y migran extensamente en el embrión siguientes rutas estereotipadas de responder a las señales de guía circundante. Una vez que han llegado a su destino final, se diferencian en una amplia gama de derivados, por ejemplo, neuronas, células gliales, huesos, cartílagos y células pigmentadas ^1-5. Debido a su contribución a muchos tipos de células y tejidos embrionarios, defectos en cualquier trámite del desarrollo de células NC, desde la inducción de la diferenciación final, puede causar síndromes congénitos con nombre neurocristopathies ^6. Emanipulación Xperimental del NC en desarrollo en diferentes etapas - de especificación, EMT, migración y diferenciación - mejorará nuestra comprensión de neurocristopathies y permitir el diseño de estrategias terapéuticas potenciales.

El embrión de Xenopus laevis es un modelo de elección para estudiar el desarrollo de NC. Un gran número de embriones son fáciles de obtener, y la fertilización externa da acceso a las primeras etapas de desarrollo. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente X. laevis desarrollo embrionario. Ganancia de función y derribo Gene son fáciles de realizar mediante la microinyección de células individuales de primeros blástulas. Tejidos embrionarios pueden ser cortados para la reasociación in vitro o ensayos de ^7-11 back-injerto ^12,13.

En este protocolo, se describe cómo diseccionar premigratorio NC craneal en X. laevis neurulas tarde, antes de la migración. Estos explantes se pueden cultivar en fibronectina-Coated placas para estudiar la migración y la diferenciación en controladas en condiciones experimentales in vitro. Explantes NC también se pueden injertar en embriones normales o manipuladas de acogida para estudiar su migración y diferenciación in vivo.

Protocolo

Los experimentos cumplen con la reglamentación nacional y europea relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento.

1. Preparación de platos recubiertos con fibronectina ¹⁴

1. Pipetear 500 ml de 10 mg / ml de fibronectina de grado cultivo diluido en 1x tampón fosfato salino (PBS) en una placa de Petri estándar de plástico (Ø 40 x 11 mm). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Nota: si usa platos de cristal o cubreobjetos de vidrio para la imagen posterior, utilice una solución de fibronectina 100 mg / ml.
2. Enjuague tres veces con PBS 1x.
3. Reemplazar PBS con 500 ml de 1x PBS/0.1% albúmina de suero bovino (BSA). Incubar a 37 ° C durante 30 min.
4. Enjuague tres veces con PBS 1x.
5. Llenar con 1x PBS y se mantenga a 4 ° C hasta su uso (por lo general de 24 a 48 h).

2. La disección de los explantes NC

1. Preparar 3/4 normal Anfibio Medio (NAM) (NaCl 110 mM, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca _{(NO3) 2,} 1 mM de _MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM de _NaHCO3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamicina ^10,15). No guardar más de 1 semana para la disección, se almacenan a 4 ° C. NAM Mayor se puede utilizar para la preparación de platos de disección de agarosa recubiertas con (abajo).
2. Preparar 60 mm placas de Petri para la disección, recubiertas con 10 ml de agarosa al 2% en 3/4 de NAM.
3. Recoger herramientas de disección: pipetas Pasteur de plástico, una mejor pasador de insecto montado sobre soporte de pasador (ver tabla materiales para la referencia), un "cuchillo de la ceja" (hecho con pelo de las cejas incrustado en parafina en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio ^16), dos fina pinza de disección, pipeta P1000 y consejos, un estereoscopio binocular con aumento de 8-40X y 50, una fuente de luz brillante con fibras ópticas guías. Todas las herramientas de disección deben mantenerse limpios, después de cada experimento, enjuagarlos dos veces con agua destilada, una vez with etanol al 100% y dejar secar. Almacene lejos del polvo.
4. Llene el plato de disección con NAM fresca casi hasta la cima.
5. Obtener X. laevis embriones de acuerdo con los procedimientos estándar ¹⁰ y ellos envejecer hasta que alcanzan Néurula etapa 16 (de acuerdo con Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo ^17).
6. Coloque etapa 16 embriones en el plato de disección utilizando la pipeta Pasteur de plástico.
7. Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes en el marco del alcance binocular. Retire la membrana vitelina con dos pares de pinzas. Tenga cuidado de no dañar la parte dorsal de los embriones.
8. Espere hasta que los embriones han llegado a la etapa 17 para iniciar la disección. Etapa 17 es apropiado, ya que la cresta neural está claramente separado del tubo neural, en contraste con las etapas anteriores. Después de la etapa 17, se inicia la migración de Carolina del Norte y mezclándose con el mesénquima circundante.
9. Cavar un agujero pequeño en la agarosa con pinzas para hacer un hueco para los embriones con el fin de mantenerdurante la disección. Coloque un embrión dorsal hacia arriba. Nota: el modelado de la arcilla puede ser usado para mantener los embriones en lugar de excavación de un agujero en la agarosa.
10. Hacer una incisión en la parte lateral del pliegue neural anterior con el cuchillo de la ceja y el pasador de insectos. Tenga cuidado de no ir demasiado profundo en el embrión: tratar de cortar a través de 2-3 capas de células (nunca llegar tan profundo como el archenteron!). Durante todo el proceso de disección, nunca permitir que los tejidos disecados para entrar en contacto con la interfaz aire-líquido desde X. tejidos embrionarios laevis se lisan por la tensión superficial.
11. Haga una segunda incisión paralela en la parte más dorsal del pliegue neural utilizando los mismos instrumentos.
12. Si es necesario, gire el plato alrededor de 90 °. Hacer tercera incisión perpendicular con el cuchillo de la ceja y la clavija de insecto, en el lado posterior de las dos primera incisiones. La NC es una gruesa masa de células por debajo de la capa externa pigmentada del ectodermo, lateralpara el tubo neural.
13. Utilice la punta de la cuchilla de cejas para separar la capa de ectodermo pigmentada de la NC subyacente, a partir de la tercera borde de la incisión.
14. Utilice el lado de la cuchilla de cejas para separar el tejido NC a partir de la tercera incisión. El tejido NC es más bien gris, mientras que el mesodermo cefálico subyacente es blanco. Separe con cuidado la Carolina del Norte a partir del mesodermo.
15. Separe el tejido NC anterior de la vesícula óptica, y cortar en este nivel para liberar el explante. Como control para la primera experimentos, comprobando la expresión Snail2 (un marcador canónica Carolina del Norte) en algunos explantes por hibridación in situ se recomienda.

3. Plating explantes de fibronectina

1. Rellena el plato fibronectina recubierto con Modificada Danilchick Medio (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO ₃ 5 mM, K Gluconato 4,5 mM, Na Gluconato 32 mM, _MgSO4 1 mM, _CaCl2 1 mM, BSA al 0,1%, se ajusta el pH a 8.3 con 1 M Bicina ^18).
2. La transferencia de los explantes en el plato fibronectina recubierto con una pipeta P1000. Nunca permita que los explantes para tocar la interfase aire-líquido. En primer lugar, la pipeta un poco de líquido en la punta, a continuación, los explantes, a continuación, algunos de nuevo líquido. No permita que el aire en la punta durante la transferencia de los explantes en el plato recubiertos de fibronectina. Una vez que la punta está dentro del líquido del plato fibronectina recubiertos, dejar que los explantes lentamente bajan por gravedad, o empujar con mucha suavidad. Evitar la expulsión de los explantes demasiado rápido.
3. Coloque 10-30 explantes en el plato con el cuchillo de la ceja. Evitar los lados del plato, que no son adecuados para la formación de imágenes posterior.
4. Trate de no mover el plato hasta que los explantes se han unido a la fibronectina (se tarda unos 15-30 minutos). Si es necesario, mueva el plato con mucho cuidado.
5. Coloque el plato en un incubador refrigerado (entre 15-20 º C, para la tabla de temperaturas ver ^17). Cuando se coloca a 15 ° C, las células are suele migrar de manera eficiente y dispersando después de 6 horas de incubación (el tiempo puede variar entre los experimentos).

4. Injerto explantes en embriones de acogida

1. Cortar un cubreobjetos de vidrio fina en piezas muy pequeñas utilizando fórceps gruesas. El tamaño de las piezas debe ser de aproximadamente 1,5 mm ^2. Sumergir los trozos en una placa de Petri que contiene de 3/4 NAM o PBS usando fórceps.
2. Preparación del embrión de acogida: diseccionar la NC anfitrión en 3/4 NAM como se describe en 3) con especial cuidado de no dañar el embrión de acogida mientras se quita la membrana vitelina y la disección de la NC. La tensión del tejido tiende a aumentar el tamaño de la ablación: dejar que el embrión de acogida curar parcialmente, mientras que la disección de la embrión donante.
3. En otro plato de agarosa recubiertas con o en otra parte del mismo plato, diseccionar el explante NC del embrión donante como se describe en el Protocolo 3. Transferir el injerto de Carolina del Norte en el plato que contiene el host con cuidado, como se describe enProtocolo 3.
4. Colocar inmediatamente el explante NC a la zona de ablación host utilizando fórceps. El explante debe adjuntar parcialmente. Ponga un pedazo de cubreobjetos de vidrio sobre el embrión injertado para mantener el injerto en su lugar. Elige un pedazo de vidrio más grande que el embrión para evitar dañarla. El embrión será un poco aplanada.
5. Espere por lo menos 15 a 20 minutos, luego retire suavemente el cubreobjetos. Deje que el embrión se recuperan durante otros 10 minutos y la pipeta con cuidado en un plato limpio lleno de 3/4 NAM, utilizando la pipeta Pasteur de plástico.

Resultados

Cuando chapada en fibronectina, los explantes de la cresta neural se adhieren rápidamente (15-30 min) y el explante se extiende plana dentro de 2 horas (Figura 1A). Después de 3-6 células hr comienzan a dispersarse. En 24 horas a 15 ° C, muchas células han comenzado a migrar fuera del explante (figuras 1B y 1C). Yema hace que las células muy brillante bajo contraste de fase (Figura 1B). Protuberancias celulares (filopodes y lamellipodes) son claramente ...

Discusión

Este protocolo describe una técnica fácil de explante premigratorio craneal NC en embriones de X. laevis. Los embriones utilizados para dichos experimentos deben ser robustos y sanar bien. Deseche cualquier lote de embriones saludables. Además, crecer los embriones a diferentes temperaturas (de 12 a 18-20 ° C), con el fin de escindir la cresta neural en la etapa 17 y no más tarde. Después de la etapa 17, la cresta neural se puede mezclar con mesodermo cefálico y no se puede eliminar completamente. Tejidos d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fibronectina de plasma bovino	Sigma	F4759-1MG
Albúmina sérica bovina, fracción V	Euromedex	04-100-811-C	El grado de calidad inferior puede ser adecuado para esta aplicación
Alfileres de insectos de acero inoxidable, tamaño 000	FST	26001
Pinza Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm	FST	11252-20