Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

Nissa L. Carrodus; Kathleen Sue-Lyn Teng; Kathryn M. Munro; Matthew J. Kennedy; Jenny M. Gunnersen

doi:10.3791/51139

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Artículo de método

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

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DOI:

10.3791/51139

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12 de febrero de 2014

Nissa L. Carrodus^*¹ , Kathleen Sue-Lyn Teng^*¹ , Kathryn M. Munro¹ , Matthew J. Kennedy² , Jenny M. Gunnersen¹^,³

¹Department of Anatomy & Neuroscience, The University of Melbourne, ²Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, ³Florey Institute of Neuroscience & Mental Health, The University of Melbourne

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.

Resumen

Con el fin de demostrar la localización de la superficie celular de un receptor transmembrana putativo en neuronas cultivadas, etiquetamos la proteína en la superficie de las neuronas en vivo con un anticuerpo primario específico generado contra una porción extracelular de la proteína. Dado que los receptores son objeto de tráfico hacia y desde la superficie, si las células se permeabilizaron después de la fijación a continuación, tanto de la superficie celular y la proteína interna serán detectados por el mismo anticuerpo secundario marcado. Aquí, hemos adaptado un método utilizado para estudiar el tráfico de proteínas ("alimentación anticuerpo") diferencialmente proteína etiqueta que había sido internalizado por endocitosis, durante la etapa de incubación de anticuerpos y proteínas que, o bien se quedaron en la superficie de la célula o se trafica a la superficie durante este periodo . La capacidad de distinguir estos dos grupos de proteínas fue posible gracias a la incorporación de un paso de bloqueo durante la noche con el anticuerpo secundario marcado altamente concentrado-después de una incubatio inicialn de las neuronas unpermeabilized con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente-. Después de la etapa de bloqueo, la permeabilización de las neuronas permitió la detección de la piscina interiorizado con un anticuerpo secundario fluorescente marcada con un fluoróforo diferente. Usando esta técnica pudimos obtener información importante acerca de la localización subcelular de este receptor putativo, revelando que era, de hecho, víctimas de la trata a la superficie celular en las neuronas. Esta técnica es ampliamente aplicable a una gama de tipos de células y proteínas de la superficie celular, proporcionando un anticuerpo adecuado a un epítopo extracelular está disponible.

Introducción

En el establecimiento de la función de las proteínas recientemente identificadas, la investigación de la localización subcelular y el tráfico de la proteína en cuestión puede proporcionar importantes pistas sobre el probable rol / s del ^1,2 proteínas. El análisis bioinformático del transcriptoma del neocórtex en desarrollo ³ nos proporcionó una lista de genes que muestran expresión alterada durante ratón corticogenesis cerebro. Adoptamos entonces un enfoque knockout de genes para determinar que la proteína codificada por uno de estos genes, sez6, tiene un papel clave en el desarrollo de las neuronas. Hemos observado que el gen relaciona....