Los microtúbulos son polímeros inherentemente inestables, y su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Aquí se describen los protocolos que utilizan microtúbulos segmentados con tapones estabilizadores fotoescindible. La despolimerización de los microtúbulos segmentados puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos con los extremos de los microtúbulos desmontaje.
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Artículo de método
Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends
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Resumen
Resumen
Despolimerización de microtúbulos puede proporcionar la fuerza para el transporte de diferentes complejos de proteínas y los granos proteicos recubierto in vitro. Los mecanismos subyacentes se cree que desempeñan un papel vital en los movimientos de los cromosomas microtúbulos dependientes durante la división celular, pero las proteínas correspondientes y sus funciones exactas están mal definidos. Por lo tanto, hay una necesidad creciente de desarrollar ensayos con el que estudiar tales motilidad in vitro utilizando componentes purificados y medio bioquímica definida. Los microtúbulos, sin embargo, son inherentemente inestables polímeros; su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Los protocolos que describimos aquí se aprovechan de los microtúbulos segmentados que se hacen con el fotoescindible estabilizar tapas. La despolimerización de microtúbulos tales segmentados se puede activar con alta resolución temporal y espacial, ayudando así a los estudios de la motilidad en los extremos de los microtúbulos desmontaje. Esta técnica se puede utilizar para CArry a cabo un análisis cuantitativo del número de moléculas en los complejos de proteínas marcadas con fluorescencia, que se mueven processively con los extremos de los microtúbulos dinámica. Para optimizar una relación señal-ruido en este y otros ensayos fluorescentes cuantitativos, cubreobjetos deben ser tratados para reducir la absorción no específica de proteínas marcadas fluorescentemente-solubles. Protocolos detallados se proporcionan a tener en cuenta la falta de uniformidad de la iluminación fluorescente, y determinar la intensidad de un solo fluoróforo utilizando ajuste gaussiano equidistantes. Por último, se describe el uso de los microtúbulos segmentados para estudiar los movimientos de los microtúbulos dependientes de las microperlas de proteína-revestido, proporcionando conocimientos sobre la capacidad de las diferentes proteínas motoras y no motoras para acoplar la despolimerización de microtúbulos al movimiento de carga processive.
Introducción
Los microtúbulos son altamente conservadas estructuras citoesqueléticas que son importantes para la arquitectura celular, la motilidad celular, la división celular, y el transporte intracelular 1. Estos polímeros dinámicos se ensamblan a partir de tubulina en presencia de GTP, y cambian de forma espontánea entre el crecimiento y acortamiento 2. Los microtúbulos son muy delgado (sólo 25 nm de diámetro), por lo tanto las técnicas ópticas especiales para incrementar el contraste debe ser utilizado para observar los microtúbulos con un microscopio óptico. El trabajo previo con estos polímeros examinó su comportamiento dinámico mediante contraste de ....
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Protocolo
Equipo necesario: Los experimentos descritos a continuación requieren de un microscopio óptico equipado para DIC y fluorescencia de imagen (Tabla 1). Campo brillante iluminación LED se puede utilizar para mejorar de manera significativa la detección de las semillas de microtúbulos cubreobjetos-adjunto 37, que son difíciles de observar con una lámpara halógena regular. Para controlar el flujo de líquido en las cámaras de microscopía, las soluciones deben ser intercambiados con una bomba peristáltica capaz de velocidades de flujo de 10 a 100 l / min. Una bomba de jeringa también se puede utilizar pero se debe tener cuidado p....
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Resultados
Proteína seguimiento con depolymerizing microtúbulos termina. Cinetocoro levadura componente Dam1 es, con mucho, el mejor consejo-tracker de los microtúbulos depolymerizing termina 14. Este complejo de 10 subunidad marcada con GFP se puede expresar fácilmente y se purifica a partir de células bacterianas 18,38, por lo que recomendamos su uso como un control positivo para el ensayo de la punta de seguimiento. Una proteína fluorescente que rastrea con el extremo despolimerización de .......
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Discusión
Muchos ensayos de una sola molécula hoy en día utilizan habitualmente cubreobjetos especialmente tratadas para reducir drásticamente la adherencia no específica de proteínas. El procedimiento se describe aquí es una modificación del protocolo original desarrollado en Howard laboratorio 32, y nos encontramos con que silanizar los cubreobjetos es bien vale la pena el esfuerzo, incluso con ensayos de cuentas basados en la DIC, que no utilizan la fluorescencia. Cámaras ensambladas con tales cubreobjetos muestra.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a FI Ataullakhanov para ayudar a diseñar y fabricar cámaras de flujo reutilizables, N. Dashkevich, N. y A. Gudimchuk Korbalev para proporcionar imágenes de figuras, N. y P. Gudimchuk Zakharov para el desarrollo de un protocolo y proporcionar reactivos para preparar semillas microtúbulos marcadas con digoxigenina, A. Potapenko para obtener ayuda con la edición de texto y otros miembros del laboratorio Grishchuk para consejos y discusiones. Esta obra fue financiada en parte por subvención NIH R01 GM-098389 y una subvención piloto de Pennsylvania Muscle Instituto de ELG, que es un Kimmel Scholar, por RFBR ofrece 12-04-00111-A, 13-04-40190-H ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tabla 1. Microscopía y otros equipos.Microscopio | |||
| Zeiss Nikon | Axio Imager 2 Eclipse Ti | pueden utilizar otros modelos de microscopio capaces de obtener imágenes DIC y de epifluorescencia | |
| Objetivo | Zeiss Nikon | 420490-9900-000 CFI Apo 100x Aceite 1.49 | 100X, DIC, 1.3-1.49 NA |
| Calentador de objetivo | Bioptechs 150803 | , 150819-19 | |
| Cubo de filtro fluorescente | Chroma | 49004 o 49008 41017 o 49020 | optimizado para fluorescencia de rodamina optimizado para la fluorescencia GFP |
| Software de adquisición | gratuito MicroManager Molecular Devices | no aplicable MetaMorph 7.5 | http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ otro software se puede utilizar para la adquisición de imágenes y para el seguimiento de partículas |
| Cámara EMCCD | Andor | iXon3, DU-897E-cs0-#BV | Cámara EMCCD de alta sensibilidad |
| Láser de trampa | IPG Fotónica | YLR-10-1064-LP | Láser de 1.064 nm, |
| excitación por fluorescencia de | Coherent, Inc. Coherent, Inc. | Zafiro 488 LP Zafiro 552 LP | Excitación de fluoróforos verdes Excitación de fluoróforos rojos |
| Limpiador de plasma | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Cámaras de flujo comerciales | Warner Instruments | RC-20 o RC-30 | |
| Bomba de perfusión | Cole Palmer Harvard Apparatus | Masterflex 77120-52 Pico Plus | Ambas bombas proporcionan la tasa requerida de flujo de líquido, pero una bomba peristáltica puede pulsar a una velocidad muy lenta. El flujo con una bomba de jeringa es más consistente para una amplia gama de tasas, pero esta bomba tiene inercia. |
| Tabla 2. Preparación de la cámara de microscopía. | |||
| Portaobjetos de microscopio modificados para cámaras reutilizables | Soplado de vidrio de precisión de Colorado | Pedido personalizado www.precisionglassblowing.com | Ranuras sónicas en portaobjetos utilizando esquemas en Figura 1 |
| Tubo de polietileno | Intramedic | 427410 | D.I. 0,58 mm, D.E. 0,965 mm; Utilice estos tubos para conectar la cámara ensamblada a la bomba y al contenedor de residuos |
| Tubo de polietileno | Intramedic | 427400 | D.I. 0,28 mm, D.E. 0,61 mm; Utilice estos tubos para hacer la cámara reutilizable |
| Portaobjetos de microscopio normales | VWR | 48312-003 | pueden utilizar otros portaobjetos similares |
| Cubreobjetos | VWR | 48393-150, 48366-067 | pueden utilizar otros cubreobjetos similares |
| Sellador de silicona | World Precision Instruments | KIT, SELLADOR DE SILICONA CURADO DE 5 MINUTOS | |
| Pegamento epoxi | Loctite | 83082 | |
| Adhesivo de cianoacrilato | Scotch 3M | AD114 | O adhesivo de cianoacrilato de otros fabricantes |
| Tabla 3. Limpieza y recubrimiento de cubreobjetos. | |||
| Tamices moleculares, grado 564 | Macron | 4490-04 | |
| Tarro de tinción de cubreobjetos | Ted Pella, Inc. | 21036 | |
| Cubreobjetos Soporte cerámico | Thomas Scientific | 8542e40 | |
| PlusOne Repel Silane | GE Healthcare Biosciences | 17-1332-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Anti-digoxigenina AB | Roche Applied Science | 11093274910 | |
| Tabla 4. Preparación de semillas y microtúbulos segmentados. | |||
| purificada a partir de cerebros de vaca Cytoskeleton, Inc | T238P | Para los protocolos de purificación, consulte 49– 51 Tubulina porcina sin etiquetar | |
| Tubulina marcada | Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen | TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenina) | La tubulina porcina marcada con rodamina puede marcarse con cualquier colorante reactivo a aminas como en referencia52. |
| GMPCPP | Jena Biosciences | NU-405 | Alícuota y almacenamiento a -70 ° C |
| VALAP | Vaselina, lanolina y parafina a 1:1:2 en masa | ver referencia9 |
Referencias
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
- Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
- Walker, R. A., Brien, O., et al.
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