Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

El desarrollo de interruptores genéticos en levaduras es de gran interés en la investigación tanto a nivel académico e industrial. En el caso ideal, interruptores genéticos pueden ser utilizados para activar un gen particular (o conjunto de genes) sólo cuando se desee por el experimentador. Secuencia de codificación de un gen situado aguas abajo de un promotor sintético no se expresa en la ausencia de una molécula de la inducción de: después de la adición del inductor del gen debe expresarse rápidamente. Se ha demostrado recientemente que un interruptor de este tipo puede ser diseñado en la levadura, donde en ausencia de inductor, la cepa muestra un fenotipo de supresión, pero en presencia de inductor, la expresión se activa en proporción al nivel de inductor en todas las células ^1,2. Históricamente, los sistemas de expresión condicional en la levadura se han basado en gran medida en las secuencias de ADN que responden a nutrientes, incluyendo la MET, FO, y promotores GAL (cuyas actividades son sensibles a los niveles extracelulares de metionina, fosfato, ygalactosa, respectivamente). Mientras que la expresión condicional se puede lograr, se trata en el coste de los efectos pleiotrópicos significativos.

Los receptores de hormonas tales como los receptores de estrógenos humanos han demostrado ser eficaces interruptores en eucariotas ^3,4. En ausencia de hormona, una proteína fusionada a un receptor de la hormona puede ser secuestrado en el citoplasma donde interactúa con el complejo chaperona Hsp90. Tras la unión del ligando apropiado, el receptor experimenta un cambio conformacional, haciendo que se libera del complejo chaperona Hsp90 y revelando una señal de localización nuclear. Para observar la dinámica de localización de una proteína que contiene al receptor de hormona en particular, hemos creado una fusión C-terminal de Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, un factor de transcripción sintética que contiene el dominio de unión de ADN Gal4p, el dominio de unión a ligando del receptor de estrógeno humano , y VP16) con GFP ^2. Localización nuclear se observó dentro de 8 min después de la adición decantidades saturantes del inductor, ß-estradiol, a la que levadura de tipo salvaje es completamente inerte. En ese momento, la mayoría de las células tienen sitios de transcripción activos claramente visibles para los genes diana GEV (ensayadas mediante hibridación in situ fluorescente), así como los ARNm completamente maduros ^2,5. Genes diana GEV aumentaron en la expresión de> 2 veces en 2,5 min ^2,6 (medido utilizando microarrays), lo que demuestra que se tarda <2,5 min para el activador quimérico para trasladar al núcleo, unirse al ADN, y activar la transcripción.

Mientras que varios otros mecanismos de activación que se han aplicado en la levadura que utilizan diversas pequeñas moléculas o fármacos (incluidos los conmutadores basados ​​en doxiciclina clásicos de Escherichia coli ^7,8 y un interruptor basado en el añil ⁹ de Arabidopsis thaliana), ninguno ha alcanzado la velocidad, especificidad, o rigidez de la regulación que presentan los switches basados ​​en hormonas. Vale la pena mencionar tsombrero rápida fuera de los interruptores también se han desarrollado en la levadura, y típicamente trabajar por la fusión de un gen para una proteasa o ubiquitina ligasa secuencia dirigida ^2,10,11,12. La capacidad de eliminar rápidamente una proteína diana de la célula facilita el estudio de los genes esenciales, así como los genes que son propensos a la supresión genética cuando se suprime ^10.

Los métodos descritos en este protocolo son para la construcción y caracterización sintética en los interruptores en la levadura. En primer lugar, se muestra cómo generar rápidamente las proteínas de fusión genómicamente integradas-que consisten en un dominio de unión al ADN de interés, el ligando vinculante de dominio del receptor de estrógeno humano y VP16 (DBD-EV). Después de nuestro protocolo, la proteína de fusión se expresa a partir de un promotor ACT1. Luego mostramos cómo crear un plásmido indicador análogo para la ATF y probar su funcionalidad mediante citometría de flujo. Aunque prevemos estos plásmidos indicadores que se utilizan con nuevos CATs (Figura 1), que pueden be utilizado como reporteros de un activador transcripcional nativa así. Finalmente, se proporcionan detalles para probar el efecto de la activación de ATF sobre el crecimiento celular en placas de 96 pocillos y para la ingeniería de alelos genómicas inducibles.

La Figura 2 proporciona un esquema de las secciones de protocolo 1-3.

1. Creación de ATF

1. Crear cebadores para PCR amplificando dominio de unión a ADN de interés. La homología con el receptor de promotor ACT1 y la hormona (tal como se describe en las Figuras 3 y 4) se añade a través de PCR para facilitar la recombinación correcta en la cepa yMN15.
2. Amplificar por PCR DBD de interés utilizando una polimerasa de alta fidelidad.
3. Transformar> 1 g de producto de PCR purificado en levadura usando el método de acetato de litio ^13.
4. Después de la transformación, las células de la vuelta a la máxima velocidad durante 15 segundos en microcentrífuga y quite mezcla de transformación.
5. Resuspender en ~ 200 l de agua estéril y placa en YPD.
6. Al día siguiente, réplica de la placa de YPD en placas 5-FOA (placas 5-FOA se hacen como se describe en el Manual de levadura Cold Spring Harbor) ^13.
7. Permitir el crecimiento de 2-4 days, y restreak al menos 5-10 colonias en YPD. Realizar una PCR de colonias usando los cebadores de la Tabla 1 y la secuencia para verificar la inclusión.

2. Creación de ATF plásmido reportero

1. Determinar el sitio de unión de la ATF (más probable que provenga de la literatura).
2. Orden deseado región de unión como los oligos (o Ultramers, si es necesario). Ordene como superior e inferior con hebras salientes correctas para NotI y XbaI como se muestra en la Tabla 2.
3. Diluir oligos a concentraciones equimolares (100 micras).
4. Fosforilan utilizando T4 polinucleótido quinasa y luego recocido en un termociclador. Las condiciones de reacción son en la Tabla 3.
5. Resumen ~ 1-2 mg de pMN8 con NotI-HF y XbaI durante 1 hora a 37 ° C (condiciones de reacción en la Tabla 4).
6. Gel purifican la banda de la columna vertebral.
7. Diluir la columna vertebral purificada a 10 ng / l.
8. Diluir la doble cadena, fosforiloATED sitio de unión a 5 veces la concentración molar de la columna vertebral por l.
9. El uso de ADN ligasa de T4, ligar los sitios de unión en la cadena principal digerido a temperatura ambiente durante 30 min (Tabla 5).
10. Para la transformación, agregue la mitad de la reacción de ligación a 50 l de estándar, Escherichia coli químicamente competentes como XL1-Blue o DH5-alfa.
11. Células de choque térmico durante 45 segundos en un 42 ° C baño de agua y luego se coloca en hielo durante 2 min.
12. Añadir 900 l de medio SOC a una reacción de transformación.
13. Crece a 37 ° C durante 1 hora en un tambor de rodillo.
14. Corre 100-200 mu l de células por LB + AMP (100 mg / ml) para placas e incubar durante la noche.
15. Crece E. coli en LB + AMP ADN plásmido líquido y la cosecha. Secuencia verifique nuevo plásmido reportero de colonias de ligamiento utilizando el cebador 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 '.
16. Transformar nuevo plásmido indicador que contiene en ATF-levadura strAin de la Sección 1 usando transformación con acetato de litio.

3. Cuantificar el efecto de la ATF inducción en la expresión génica utilizando GFP reportero

Preparación de las muestras:

1. Hacer 25 mM de stock β-estradiol (10 ml de etanol + 0,0681 g de β-estradiol). Mantener refrigerado.
2. Grow ATF + Periodista que contienen la cepa durante la noche en 5 ml SC-URA.
3. Obtener nueve 250 ml frascos de agitación y añadir 25 ml SC-URA a cada uno.
4. Añadir 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 mM, o 10 mM β-estradiol. Esto se hace más fácilmente al hacer diluciones seriadas de 10 veces de la acción β-estradiol 25 mM. Para obtener una concentración final de 10 mM β-estradiol, añadir 10 l de la población de β-estradiol 25 mM a 25 ml de SC-ura.
5. Añadir 125 l de cultivos de una noche a matraces (1:200 dilución).
6. Durante los 2 frascos restantes, inocular con una producción de GFP constitutiva strain y una cepa que carece de buenas prácticas agrarias. Estos son necesarios para la calibración del citómetro de flujo.
7. Agitar a 200 rpm a 30 º C durante 12-18 horas.
   Nota: El tiempo óptimo de incubación se determina mediante la identificación de las buenas prácticas agrarias de inducción cuando ya no cambia tras la adición de β-estradiol.
8. Tomar 500 l de cada cultura y de girar en tubos de 1,7 ml de microcentrífuga separados.
9. Aspirar SC-URA.
10. Lavar una vez en 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 y aspirado.
11. Añadir 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 y resuspender.
12. Añadir 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 a tubos Falcon.
13. Añadir las células resuspendidas a tubos de 5 ml (volumen final = 2 ml) (se puede almacenar a 4 ° C durante varios días).
14. Opcional: células Sonicar ligeramente para cualquier ruptura de células agrupadas.
    La citometría de flujo análisis: Información general: La fluorescencia de 10.000-100.000 células se analiza normalmente por muestra. Los datos pueden ser procesados ​​ni en FlowJo o utilizar scripts personalizados en MATLAB oR. Asegúrese de calibrar el voltaje del canal GFP GFP utilizando controles positivos y negativos. Una vez que los archivos de FCS se exportan, un guión como el de la Figura 6, junto con los fca_readfcs función ( http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader ) se puede utilizar para procesar el datos.
15. Lleve a cabo la citometría de flujo.
    1. Uso dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para identificar las células de levadura.
    2. Ajuste el caudal de ~ 3.000 células / seg.
    3. Mida GFP (canal FITC).
    4. Una vez que se recopilan los datos, archivos de exportación. FCS
16. Cargue MATLAB.
17. Mueva los archivos. FCS, fcs_readfcs.m y un guión similar al de la Figura 6 en la misma carpeta.
18. Cambie el directorio de trabajo actual a la carpeta que contiene los datos y scripts.
19. Ejecute el script de la Figura 6 (nota: laleyenda ha sido introducida manualmente para producir lo que se ve en la figura 7).

4. Cuantificar el efecto de la ATF inducción sobre el crecimiento celular

1. Desde existencias congeladas, veta a cabo tanto (1) una cepa que contiene ATF-y (2) una cepa ATF-faltando (tal como yMN15) en placas de YPD separadas.
2. Después de 2 días de crecimiento, inocular tubos de cultivo separados que contienen 5 ml de líquido YPD con cada cepa y crecer durante la noche a 30 ° C.
3. Lleve a cabo 10 veces diluciones seriadas de un mM β-estradiol solución 0,25 abastecerse de 10.000 veces (0.025 M β-estradiol) en etanol al 100%.
4. Añadir 40 l de cultivos durante la noche a 10 ml de líquido YPD (1-250 dilución).
5. Para cada cepa, añadir 96 l de células diluidas a 18 pocillos de una placa de 96 pocillos.
6. Añadir 4 l de β-estradiol a las células. Un punto esencial es asegurarse de que cada pozo tiene la misma cantidad de etanol total. (Como alternativa, un mo re madre concentrada de β-estradiol se puede utilizar y se diluyó posteriormente hasta el punto el efecto del etanol sobre el crecimiento no es medible).
7. Lleve a cabo por triplicado. Tres de los pozos para cada cepa debe ser de sólo etanol controles.
8. Cubrir la placa de 96 pocillos de gas permeable.
9. Controle atentamente el crecimiento (OD ₆₀₀₎ en un lector de placas.
10. Cuantificar las tasas de crecimiento utilizando cualquier número de métodos estándar tales como encontrar la pendiente máxima.
    Nota: Hemos tenido buen éxito con el código abierto del paquete de software Grofit ^14, que se ejecuta en el entorno de programación R Vale la pena mencionar que, si bien las tasas de crecimiento calculadas a partir de los ensayos de placa de 96 pocillos en comparación con matraces de agitación (25 ml culturas). no son necesariamente los mismos (debido tanto a las diferencias en la fisiología y en la instrumentación), que hemos observado que las tasas relativas de crecimiento son similares (aunque esto puede no ser siempre el caso).

1. Obtener pMN10, un plásmido noncentromeric con el promotor-ATF sensible de pMN8 fusionado a KanMX (en la orientación opuesta).
2. Digestión de restricción de la cadena principal del vector y el extracto de gel como en la Sección 2.
3. Recocido, fosforilar y oligos ligar contienen sitios de unión apropiadas como se describe en la Sección 2.
4. Secuencia de verificar. Este plásmido ahora servirá como un molde de ADN para crear el alelo inducible.
5. Obtener la cepa de levadura que expresa la ATF correspondiente de intereses.
6. Amplificar por PCR el casete KanMX-Promotor (~ 2 kb) usando los cebadores de la Tabla 6.
7. Transformar el producto de la PCR en la cepa de ATF-expresar utilizando el método de acetato de litio.
8. Placa en YPD y réplica placa en YPD + G418 al día siguiente.
9. Confirmar la inserción apropiada del promotor utilizando el cebador directo (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 ') y un cebador inverso interno a the gen cuyo promotor ha sido sustituido. El cebador inverso está típicamente diseñado para ser de entre 200-300 pb aguas abajo de la primera ATG de ^15. El producto final de la PCR es de ~ 1,2 kb.

La Figura 5 muestra la inducción de la GFP por Z 3 EV, Z 4 EV, o GEV con el tiempo. Tenga en cuenta el aumento de la producción de GFP en respuesta a los ATF que contienen dominios de unión a ADN nonyeast. Recientemente hemos especulado que esto resulta de estos factores que han alcanzado la especificidad de un solo gen en el genoma de la levadura 1. Inducción GEV solo conduce a la activación / represión de cientos de genes, mientras que Z y Z 3 EV 4 EV sólo activar la expresión de un gen diana colocado aguas abajo de un promotor sintético que contiene sitios de unión apropiados (5'-GCGTGGGCG-3 'y 5'- GCGGCGGAGGAG, 3 ', respectivamente) 1. Figura 7 demuestra la estrecha regulación del sistema (no hay resultados inductor en ninguna de GFP detectable) y se que todas las células se inducen en respuesta a inductor La capacidad de Z 3 EV para inducir GFP a través de una gama de concentraciones de β-estradiol se muestran en la Figura 8.

Figura 2. Esquema del protocolo para las cepas de ingeniería que contienen factores de transcripción artificiales y construcción / prueba GFP reporteros afines.

load/51153/51153fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg "/>
Figura 3. La secuencia ACT1pr-URA3-EV en la cepa yMN15 en el locus LEU2.

Figura 4. Diseño de cebadores de PCR para la amplificación de un dominio de unión de ADN de interés con una homología de secuencia adicional para generar una nueva proteína de fusión cuando transformado con éxito en yMN15.

Figura 5. Inducción GFP por tres diferentes pares de ATF-promotor en respuesta a 1 mM β-estradiol. </ P>

Figura 6. Una secuencia de comandos de MATLAB para el flujo de procesamiento de datos de citometría. Este guión fue adaptado de http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data .

Figura 7. Inducción de GFP por Z 3 EV en respuesta a 0 μ M β-estradiol y 1 mM β-estradiol siguientes 18 h de inducción. Fluorescencia era también MEASured de células que carecen de buenas prácticas agrarias para ilustrar la regulación estricta del sistema EV Z 3. Esta cifra se ha generado utilizando el código de la figura 6.

Figura 8. La relación entre la concentración de inductor y de salida expresión se clasifica con un coeficiente de Hill de ~ 1. (A) Distribución de la expresión de GFP como una función de la concentración de β-estradiol. (B) La fluorescencia media de las distribuciones de (A). Los datos se ajustaron a la función G (D) = G + min (G max-G min) D n / (n + D K n), donde D es la dosis-β estradiol, G y G min max son los valores mínimo y máximos valores de las buenas prácticas agrarias, respectivamente, n es el coeficiente de Hill, y K es la dosis-β estradiol que produce ½ (G máx + G min).

Tabla 1. Los cebadores para confirmar la correcta fusión de DBD de interés para el receptor de estrógeno. El cebador directo es homóloga del promotor ACT1 y el cebador inverso es homóloga al receptor de estrógeno. Para DBDs típicos (~ 300 pb), el producto de la PCR es <1,5 kb.

Tabla 2. S tructura de cebadores para la creación de ADN de doble cadena que contiene los sitios de unión de intereses. Para crear el Z3 promotor-EV sensible, + 6x Zif268 se utilizaron los oligonucleótidos Binding Top oligo + 6x Zif268 sitios de unión y oligo Bottom.Secuencias para la creación de los voladizos de ADN correctas son en minúsculas. El sitio de unión consenso Zif268, GCGTGGGCG, se subraya en el oligo superior.

Tabla 3. Fosforilar y cebadores de recocido en un termociclador con 50 l de reacción descrita anteriormente. Hay dos pasos del termociclador. Paso 1: 37 º C 30 min (fosforilar), y el paso 2: 95 º C 30 seg (dimitir 1 ° C cada 30 segundos hasta que a 4 ° C; Recocido).

Tabla 4. Digestión de restricción del plásmido pMN8 con XbaI y NotI.

Tabla 5. Ligar sitios de unión en el ADN plásmido.

Tabla 6. Amplificar por PCR KanMX-Promotora para hacer alelo titratible.

McIsaac, Noyes y Botstein (con otros) han presentado parte de este sistema en su Descripción de la Patente.