Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo para aislar exosomas de la orina humana utilizando una técnica de precipitación modificada.

Resumen

La identificación de biomarcadores que permiten la detección temprana de enfermedades renales en orina y plasma ha sido un área de interés activo durante varios años. Las vesículas urinarias de exosomas, de 40-100 nm de tamaño, son liberadas en la orina en condiciones normales por células de todos los segmentos de nefronas y pueden contener proteínas, ARNm y microARN representativos de su tipo celular de origen. En condiciones de disfunción o lesión renal, los exosomas pueden contener proporciones alteradas de estos componentes, que pueden servir como biomarcadores de la enfermedad. Actualmente existen varios métodos disponibles para el aislamiento de exosomas urinarios, y previamente hemos realizado una comparación experimental de cada uno de estos enfoques, incluyendo tres basados en ultracentrifugación, uno utilizando un concentrador de ultrafiltración de nanomembrana, uno utilizando un reactivo de precipitación comercial y uno utilizando una modificación de la técnica de precipitación utilizando el reactivo ExoQuick que desarrollamos en nuestro laboratorio. Descubrimos que el método de precipitación modificado produjo el mayor rendimiento de partículas de exosomas, miARN y ARNm, lo que hace que este enfoque sea adecuado para el aislamiento de exosomas para el posterior perfil de ARN. Concluimos que el método de precipitación de exosomas modificados ofrece una alternativa rápida, escalable y eficaz para el aislamiento de exosomas de la orina. En este informe, describimos nuestra técnica de precipitación modificada utilizando el reactivo ExoQuick para aislar exosomas de la orina humana.

Introducción

Exosomas urinario son pequeñas vesículas internas de 100 nm de los cuerpos multivesiculares (MVB) derivados de todos los tipos de células en condiciones normales y patológicas en el espacio urinario incluyendo podocitos glomerulares, células del túbulo renal y las células que revisten los sistemas de drenaje urinario que parecen ser enriquecido para miRNAs ^{1 -2.} Muchos investigadores han detectado proteínas distintas en exosomas aislados de la orina de individuos sanos, así como aquellos con insuficiencia renal y / o enfermedades sistemáticas ^3-5. Los exosomas se pueden aislar utilizando diferentes métodos, tales como de dos etapas de ultracentrifugación diferencial con o sin sacarosa ^6-7, la combinación de filtro nanomembrana con ultracentrifugación ^{8-9, 10-11} o precipitación. Recientemente hemos desarrollado un método simple, rápido, escalable y eficaz para aislar exosomas urinario y detectar miRNA y biomarcadores de proteínas ^11. Aunque los biomarcadores pueden ser detectados en una variedad de diferentes fluidos biológicos, urine es la opción más conveniente para los pacientes con enfermedades de los riñones y del tracto urinario, ya que puede obtenerse en grandes cantidades de una manera relativamente no invasiva.

Aunque existen varios métodos para aislar exosomas urinario ^6-11, el procedimiento más comúnmente utilizado depende de ultracentrifugación diferencial con un colchón de sacarosa al 30%. Si bien este método es eficiente y la calidad de los exosomas resultantes aisladas con este procedimiento es alto, la técnica en sí requiere de personal capacitado y consume mucho tiempo, que requiere varios pasos de ultracentrifugación. Otros métodos, tales como filtración y precipitación, se han desarrollado para el aislamiento de exosomas, incluyendo uno que utiliza un reactivo de precipitación de propiedad (es decir, ExoQuick-TC: Biosciences sistema; Mountain View, CA). Aunque precipitación usando este reactivo es rápido y relativamente fácil, la pureza de los exosomas aislados es baja en comparación con la ultracentrifugación metod. Recientemente nos comparamos seis métodos para el aislamiento de los exosomas urinario, incluyendo una modificación del método de precipitación usando ExoQuick-TC que hemos desarrollado en nuestro laboratorio ^11. Encontramos que este método de precipitación modificado produjo mayores cantidades de proteína, miRNA y los ARNm y el procedimiento en sí era más rápido y más fácil de implementar que ultracentrifugación. Aquí se describe el protocolo experimental de nuestro método de precipitación modificado de una manera gradual, e incluir un análisis de las ventajas y desventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de aislamiento exosome. El método de precipitación modificada implica una precipitación inicial de partículas de exosoma, seguido de la eliminación de la proteína de Tamm-Horsfall, que se correlaciona con las proteínas exosomal, y se sabe que reducir el rendimiento exosome de la orina. Se encontró que estas modificaciones aumentan el rendimiento y la pureza de la preparación exosomal de la orina.

Protocolo

NOTA:. Los pasos implicados en el aislamiento de los exosomas urinarios utilizando el método de precipitación modificado se ilustran en la Figura 1 Los primeros pasos implican la eliminación de grandes células muertas y los desechos celulares por centrifugación. El sedimento final obtenido a partir del sobrenadante recogido de cada paso subsiguiente corresponde a la exosome, que se disuelve en solución de aislamiento para una mayor extracción de proteína, ARN y ADN.

1. Recolección de orina

1. Antes de la recogida de orina, preparar cóctel inhibidor de proteasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante y añadir 3,125 ml de este cóctel a un receptáculo estéril vacía. El tubo que contiene el cóctel inhibidor de la proteasa se puede distribuir a los voluntarios para la recogida de orina.
   NOTA: La razón de la adición de inhibidor de la proteasa es reducir al mínimo la degradación de proteínas en la muestra de orina. Aunque hemos utilizado específicamente un cóctel inhibidor de la proteasa deSigma, otros inhibidores de la proteasa comercialmente disponibles pueden ser sustituidos.
2. Recoger aproximadamente 10 ml de orina de primera evacuación. Procesar la orina inmediatamente después de la recolección sin almacenamiento o refrigeración. Aislar los exosomas urinario en duplicado utilizando el método de precipitación modificado; uno de los duplicados es para el ADN, el ARN total y la extracción de proteína, mientras que el otro es para la cuantificación de partículas de exosoma urinario.
   NOTA: Una muestra de orina de 24 horas se pueden recoger para el aislamiento exosome mediante el almacenamiento a 4 ° C.

2. La eliminación de los restos celulares y Tamm-Horsfall Proteína (THP)

1. Transferir las muestras de orina de 15 ml tubos de centrífuga. Centrifugar 10 ml de orina a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C para eliminar las células y los residuos celulares (Figura 1).
2. Con una pipeta, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para su posterior procesamiento. Resuspender el precipitado en 500 l de solución de aislamiento (sacarosa 250 mM, 10 mM prueba lasanolamine, pH 7.6) seguido de 10 min de incubación con DL-ditiotreitol (DTT: concentración final de 200 mg / ml) a 37 ° C.
   NOTA: la TDT se añade para degradar THP, que atrapa los exosomas, lo que lleva a la disminución de los rendimientos. Tenga cuidado de dejar el pellet inalteradas durante la transferencia del sobrenadante, y confirme que el sobrenadante esté libre de pellets.
3. Muestras de pellets Vortex cada 2 minutos hasta que la pastilla se disuelva completamente. A continuación, añadir 500 l de solución de aislamiento al sedimento disuelto.
4. Inmediatamente después de la adición de solución de aislamiento al sedimento, se centrifuga a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C. Pipetear el sobrenadante y se combinan con el sobrenadante recogido antes.
5. Resuspender el precipitado en 50 l de solución de aislamiento para el análisis de SDS-PAGE.
   NOTA: PBS o TBS se pueden utilizar en lugar de solución de aislamiento para resuspender el pellet.

3. Aislamiento de exosome Pellet

1. Para 11 ml de la supern recogidaatant, añadir 3,3 ml de reactivo de ExoQuick-TC y se incuba a 4 ° C durante al menos 12 h.
   NOTA: La relación de volumen de sobrenadante a reactivo ExoQuick-TC se puede ajustar para aumentar o disminuir el rendimiento exosomal. Hemos observado que menores volúmenes de reactivo añadido producen rendimientos más pequeños de exosomas.
2. Después de la incubación, se centrifuga la mezcla de muestra / ExoQuick-TC a 10.000 xg durante 30 min a 25 ° C.
3. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para el análisis SDS-PAGE.
4. El sedimento exosome se puede almacenar a -80 ° C para el ADN, el ARN y la extracción de proteínas y cuantificación de las partículas de exosoma usando ELISA ¹¹ CD9.
   NOTA: El sedimento exosome se puede almacenar a -80 ° C durante 1 año con la congelación y descongelación limitada.

4. La detección de biomarcadores y Análisis de exosome Pellet

1. Para los análisis corriente abajo, extraer el ADN, ARN y proteínas a partir del sedimento usando el exosome / ARN / kit de aislamiento de proteínas de ADN y un ki aislamiento de ARNt de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar las concentraciones utilizando un espectrofotómetro Nanodrop midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm con 2 l de muestra.
2. Realizar cuantitativa en tiempo real RT-PCR (qPCR) utilizando ensayos TaqMan microARN (en nuestro caso, hemos utilizado miR-192- y 1207-5p específicas MIR ensayos humanos) o cebadores miRNA-específicos.
3. Para el análisis de SDS-PAGE, usar 4-12% de gel de Bis-Tris y muestras de proteínas separadas por electroforesis unidimensional. Visualizar geles utilizando el kit de tinción de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Realizar análisis de transferencia de Western usando membranas de PVDF de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Use anticuerpo policlonal de conejo a la apoptosis ligada al gen-2 interactuando proteína X o ALIX y anticuerpo monoclonal de ratón a genes de susceptibilidad tumoral 101 proteína o TSG101 en la detección de Western blot. Cuantificar la densidad de las bandas por el libre acceso software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oun programa similar.
5. Cuantificar el número de partículas de exosoma urinarios obtenidos usando un kit de ELISA CD9 según las instrucciones del fabricante.

Resultados

Exosomas urinarios llevan proteínas, miRNA y de ARNm biomarcadores secretadas por las células epiteliales renales. El aislamiento y la detección de estos exosomas pueden proporcionar una herramienta de diagnóstico útil para la detección precoz de enfermedades renales tales como la nefropatía diabética. Hay varios métodos para el aislamiento de exosomas a partir de muestras de orina recogidas de sujetos humanos. Anteriormente comparamos seis métodos de aislamiento exosome orina y se investigaron resultante de proteínas, ...

Discusión

La mayoría de los métodos que implican la precipitación de exosomas de la orina no se ocupan de la eliminación de la red polimérica formada por la proteína de Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente en grandes cantidades en la orina, donde supuestamente trampas exosomas durante la centrifugación inicial baja velocidad. En nuestro método modificado redujimos THP utilizando la TDT antes de la precipitación exosome. Como se muestra en la Figura 2, se observó una mayor cantidad de THP en la orina s...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de centrífuga Corning de 15 ml	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Cóctel de inhibidores de la proteasa	Sigma Aldrich	P8340
Centrífuga	Sorvall
DL-ditiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	utilizada a una concentración final de 200 mg/ml
Sistema Novex NuPAGE SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 pocillos	Invitrogen	NP0321BOX	Para el análisis SDS-PAGE
ECL Advance Kit de detección de Western blot	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	Para la detección de biomarcadores con Western blot Sistema de
reactivos Exoquick-TC	Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Para el aislamiento de exosomas
Exosoma CD9 ELISA Complete Kit System	Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Para la cuantificación de exosomas
AllPrep Mini kit de ADN/ARN/Proteínas	Qiagen	80004	Para ADN, ARN, Aislamiento de proteínas
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 Espectrofotómetro UV-Vis	Thermo Scientific		para la cuantificación de proteínas
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Para la tinción de geles
SDS-PAGESistema de electroforesis Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies		Para ejecutar los geles SDS-PAGE
Ensayos de microARN TaqMan	Life Technologies		Para ensayos RT-PCR
Software qBasePlus v1.5	Biogazelle NV		Para el análisis de datos de ensayos RT-PCR
Anticuerpo policlonal de conejo contra ALIX	Millipore		Para la detección de biomarcadores
por Western blotAnticuerpo monoclonal de ratón contra TSG101	Abcam		para la detección de biomarcadores por Western blot