Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.
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Artículo de método
Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes
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Resumen
Resumen
La neumonía es una de los principales problemas de salud en países en desarrollo e industrializados y se asocia con una considerable morbilidad y mortalidad. A pesar de los avances en el conocimiento de esta enfermedad, la disponibilidad de las unidades de cuidados intensivos (UCI), y el uso de potentes agentes antimicrobianos y vacunas eficaces, las tasas de mortalidad siguen siendo elevados 1. Streptococcus pneumoniae es el patógeno principal de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y una de las causas más comunes de la bacteriemia en seres humanos. Este patógeno está equipado con un arsenal de adhesinas de superficie expuesta y factores de virulencia que contribuyen a la neumonía y la enfermedad neumocócica invasiva (ENI). La evaluación de la función in vivo de los factores de aptitud o de virulencia bacteriana es de suma importancia para desentrañar S. mecanismos de patogenicidad pneumoniae. Los modelos murinos de neumonía, bacteremia y meningitis se utilizan para determinar el impacto de los factores de neumococo en difeFerent etapas de la infección. Aquí se describe un protocolo para controlar la difusión de neumococo en tiempo real en los ratones después intranasal o infecciones intraperitoneales con bacterias bioluminiscentes. Los resultados muestran la multiplicación y difusión de neumococos en el tracto respiratorio inferior y la sangre, que puede ser visualizado y evaluado utilizando un sistema de imagen y el software de análisis adjunto.
Introducción
Infecciones de las vías respiratorias causadas por virus o bacterias siguen siendo uno de los problemas o adquiridas en la comunidad clínicas más comunes en todo el mundo que causan aproximadamente un tercio de todas las muertes en todo el mundo. Las especies bacterianas clave son Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae 2. Sin embargo, estas especies bacterianas son normalmente constituyentes comunes de la flora del tracto respiratorio naturales. Así carro bacteriana es también de cierto riesgo para la enfermedad invasiva y dependiendo del estado inmunitario o predisposiciones de los individuos. La colonización asintomática se dispara a las infecciones invasivas. Streptococcus pneumoniae es el patógeno principal de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y una de las causas más comunes de la bacteriemia en los seres humanos. En individuos sanos S. pneumoniae (neumococo) son a menudo asintomáticos colonizadores e inofensivos del tracto respiratorio superior, donde se enfrentan a las bacterias patógenasde la flora residente, sino también con agentes patógenos como Haemophilus spp. o Staphylococcus aureus y la primera línea del sistema de defensa inmunológico humano. Las tasas de transporte son más altos en los niños pequeños (37%) e incluso superior en los centros de atención de día de hacinamiento (58%) 3-5. La población más joven y el anciano, que recibe el neumococo a través de la transmisión por aerosol de los transportistas y las secreciones nasofaríngeas 6, pertenecen a los grupos de alto riesgo y la vacunación con una de las vacunas neumocócicas conjugadas (PCV10 o PCV13 en niños y 23-valente polisacárida PPSV23 en adultos) se recomienda en los Estados Unidos (EE.UU.) y muchos países europeos 4. El PPSV23 cubre los serotipos responsables de ~ 90% de las enfermedades neumocócicas bacteriemia en los EE.UU. y Europa, la prevención de enfermedades neumocócicas así eficientemente invasiva (ENI) en los adultos, mientras que los PCVs cubren los serotipos más prevalentes en los niños. En consecuencia, la ENI por tipos vacunales (VT) se reduserotipos no vacunales ced pero que muestran un alto potencial de virulencia y resistencia a los antibióticos se han convertido 4,7-12. La nasofaringe como reservorio es el punto de partida de los neumococos a extenderse a los senos paranasales o el oído medio que inician infecciones locales dañinos. Más importante aún, los neumococos difundir directamente a través de la vía aérea a los bronquios y del pulmón que resulta en peligro la vida de la PAC 4,13. Las infecciones pulmonares son acompañados a menudo con el tejido y destrucción de la barrera, lo que permite al patógeno a extenderse a la sangre y causando IPD. Las incidencias de la PAC y la ENI son más altos en personas inmunodeprimidas o en los extremos de 4,13 años. Las circunstancias responsables de la conversión de un comensal a un patógeno con alta virulencia son aún objeto de debate. Sin embargo, además de los cambios en la susceptibilidad del huésped y la adaptación evolutiva acompañado con una mayor virulencia y el aumento de la resistencia a los antibióticos se han sugerido a tener un impacto crucial en el PNEinfecciones umococcal 14-16.
El patógeno está dotado de una multiplicidad de adhesinas que median el contacto íntimo de la mucosa células epiteliales. Después de superar la mucosidad de las vías respiratorias, la adhesión de neumococo a las células huésped se facilita a través de interacciones directas de adhesinas de superficie expuesta con los receptores celulares y mediante la explotación de componentes de la matriz extracelular o proteínas séricas como moléculas puente 4,17,18. Patógenos Como versátiles neumococos también están equipados con los factores involucrados en la evasión de los mecanismos de defensa del huésped inmune. Además, tienen la capacidad de adaptarse a diversos ambientes huésped, tales como el pulmón, la sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR), respectivamente 5,17,19,20.
El impacto de los factores bacterianos en las respuestas de la patogénesis y de acogida inflamatoria se investiga en modelos animales experimentales de la neumonía, bacteriemia o meningitis 21-25. A pesar de ser un patógeno humano, estos modelos son nosotrosll establecida para descifrar tropismo tisular neumocócica, los mecanismos de virulencia, o protectividad de candidatas a vacunas neumocócicas. El fondo genético de cepas puras ratón determina la susceptibilidad a los neumococos. Ratones BALB / c por vía intranasal infectados con neumococos se encontró que eran resistentes, mientras que CBA / Ca y SJL ratones eran más susceptibles contra infecciones neumocócicas 22. Esto implica que, de forma similar a los seres humanos, los antecedentes genéticos y los mecanismos de defensa del huésped determinar el resultado de la infección. Por lo tanto, se necesitan más esfuerzos para desentrañar loci de resistencia en el genoma de los ratones menos susceptibles a las infecciones neumocócicas. Los resultados han dado lugar a cambios en los protocolos de virulencia en vivo. En lugar de los ratones BALB / c endogámicos de uso frecuente en el pasado, las cepas de ratón outbred CD-1/MF1 altamente susceptibles se utilizan hoy en día a menudo para estudiar el efecto de la virulencia o la aptitud neumocócica pérdida de la función de factores de 26-28. Por otra parte, la disponibilidadde neumococos bioluminiscente y técnicas de formación de imágenes ópticas permite que el tiempo real bioimagen bioluminiscencia de las infecciones. En neumococos el casete del gen de luxABCDE optimizado (plásmido Paul-Un Tn 4001 luxABCDE Km R) ha sido insertado en un único sitio de integración del cromosoma por mutagénesis de transposones. Neumococos bioluminiscente se han empleado para evaluar la atenuación de los mutantes deficientes en neumocócicas de virulencia o aptitud factores y su translocación desde un sitio anatómico a otro 26,28-31.
Aquí les ofrecemos un protocolo para la bioimagen de infecciones neumocócicas en una neumonía murina o modelo de sepsis. La amplificación y la difusión de neumococos bioluminiscente en ratones por vía intranasal o por vía intraperitoneal infectados pueden ser fácilmente monitorizados en el tiempo utilizando un sistema de imagen óptica y el mismo animal en diferentes puntos de tiempo.
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Protocolo
Los experimentos de infección de los animales que aquí se describen deben realizarse en estricta conformidad con los planos local e internacional (por ejemplo, la Ley de Salud de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA)) directrices y reglamentos para el uso de animales vertebrados. Los experimentos tienen que ser aprobados por el comité de ética local y Comité de Cuidado de Animales institucional. Todos los experimentos con S. pneumoniae en el laboratorio o las infecciones en los animales se llevan a cabo en una Clase II Bioseguridad Gabinete.
1. Preparación de la Bolsa de Infecciosas de bioluminiscente Pneumocococi
- Preparar cultivos madre neumocócicas en caldo Todd-Hewitt suplementado con 1% (w / v) de extracto de levadura y una concentración final de 20% de glicerol para el mantenimiento a 80 º C.
- Placa de una pequeña cantidad de la cultura de stock neumocócica congelado en una placa de agar sangre e incubar las bacterias durante 10 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. Tplaca de agar sangre que contiene los antibióticos apropiados, tales como kanamicina (150 mg / ml) para la inserción del transposón de la casete del gen de luxABCDE en el genoma.
- Sub-cultivar una colonia fresca en una nueva placa de agar sangre para un máximo de 10 horas.
- Inocular THY medio suplementado con 10% (v / v) inactivado por calor (30 min a 56 ° C) de suero bovino fetal (FBS) con neumococos y empezar el cultivo a una DO 600 de 0,05-0,07.
- Incubar neumococos sin agitación a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que el cultivo alcanzó una DO 600 de 0,35 a 0,40. El crecimiento dura entre 3-4 horas.
- Neumococos cosecha por centrifugación a 3750 xg durante 10 min y resuspender neumococos bioluminiscente en solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4 (PBS) suplementado con 0,5% de FBS.
- Ajuste el inóculo a la concentración deseada en PBS/10% de FBS. La dosis de infección depende de la cepa de neumococo utilizado y los antecedentes genéticos del micrófonoe. Para infectar outbred ratones CD-1 por vía intranasal con S. pneumoniae D39 lux la dosis de infección se debe ajustar a 1 x 10 7 UFC en una suspensión de 20 l suplementado con 90 unidades de hialuronidasa. No agite o vórtice neumococos, ya que esto dará lugar a la autolisis.
- Comprobar la concentración de inóculo mediante siembra de diluciones seriadas 10 veces en agar sangre y el recuento de las colonias después del crecimiento durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2.
- Verificar la bioluminiscencia del inóculo neumocócica mediante la medición de la bioluminiscencia usando un sistema de imagen óptica.
2. Intranasal y la infección intraperitoneal de ratones con neumococos bioluminiscente
- Utilice ratones hembra consanguínea en la edad de 7-10 semanas para la neumonía aguda y el modelo de sepsis. El peso de estos ratones debe estar entre 20-30 g.
- Anestesie ratones por inyección intraperitoneal de ketamina y xilazina. Prepare una mezcla de 1,0 mgketamina y 0,1 mg de xilazina en 100 l estéril al 0,9% (w / v) de cloruro sódico para ratones con un peso corporal de 20 g. Esto es consistente con una dosis de 50 mg / kg de peso corporal para la ketamina y 5 mg / kg de peso corporal para xilazina. Para ser exactos, pesar los ratones antes de la inyección de los anestésicos.
- Se inyecta la mezcla en la cavidad intraperitoneal y colocar los animales dentro de la jaula hasta que los anestésicos actúan y los animales son narcotizados. La respiración de los ratones será muy lento y regular. Los ratones tienen que ser totalmente narcotizado, de manera que la inoculación intranasal y la inhalación de la suspensión bacteriana no darán lugar a estornudos y, por tanto, la pérdida de inóculo. Esto se puede evaluar por pellizcar el ratón en el extremo de su cola; un ratón totalmente narcotizado carecerá de la capacidad de respuesta.
- Recoger suavemente hasta un ratón narcotizado y mantenga pulsado el ratón entre los dedos y el pulgar, con la nariz en posición vertical (Figura 1).
- Utilice una pipeta con largas puntas estrechas (Gel LoaderTips) y colocar los neumococos bioluminiscente en múltiples pequeñas gotas en las fosas nasales (10 l / ventana de la nariz) del ratón 26-29. El ratón involuntariamente inhalar la bacteria. Mantenga el ratón 1-2 min en posición vertical y observe si el ratón estornuda o mantiene el inóculo.
- Infect 7-10 semanas de edad ratones CD-1 por vía intranasal con una dosis de infección de 1 x 10 7 o 7,5 x 10 7 neumococos de D39 cepa y TIGR4, respectivamente, para controlar la infección en tiempo real. El límite de detección para el sistema sin ninguna absorción por el tejido del huésped es de aproximadamente 1 x 10 6 bacterias bioluminiscentes.
- Infectar ratones por vía intraperitoneal (IP) para evaluar y bioimagen virulencia del neumococo en un modelo de infección sepsis ratón. Utilice 5 x 10 3 UFC en 100 l de D39 tensión y 1 x 10 4 de cepa TIGR4. Los ratones no son anestesiados utilizando la ruta IP.
- Se inoculan los ratones de control con PBS.
Figura 1. Infección intranasal de ratones CD-1 con S. pneumoniae. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
3. Visualizar neumocócica Difusión en el Pulmón y la Sangre Usando el sistema de imágenes
Difusión de imagen de neumococos después de la infección intranasal de ratones CD1 hembras consanguíneos en tiempo real, utilizando un sistema de imagen en vivo.
- Encienda el sistema de imagen e iniciar el software de análisis de imágenes se encuentra en el equipo preconfigurar.
- El sistema de imágenes inicializa automáticamente y la cámara CCD se enfría termoeléctricamente a 90 ° C antes de ser activo.
- Los ajustes y hurgar en la basura dependen del número de ratones medidosimultáneamente y en la fuerza de la señal bioluminiscente. El campo de visión (FOV) para supervisar la bioluminiscencia de los animales es variable y la ampliación oscila entre un campo de visión de 22,5 cm para medir cinco ratones, y un campo de visión de 3,9 cm para medir un solo ratón o partes del animal como el pecho o la cabeza.
- Utilizar habitualmente un tiempo de exposición de 1 min, un grado medio de hurgar en la basura, y un campo de visión de 22,5 cm (conjunto D). En primer lugar, seleccionar el modo de imagen luminiscente y luego configurar los parámetros de la imagen.
- La emisión de la señal puede depender de la cepa bacteriana y cepa de ratón utilizado, y el pigmento del ratón. Afeitar el pecho de los ratones cuando se utiliza por ejemplo, ratones C57BL / 6, que puede ser ventajoso cuando obtención de imágenes del desarrollo de neumonía en estos ratones.
- Imagen ratones infectados a intervalos de tiempo preseleccionado. Mida la bioluminiscencia de los ratones en el modelo de neumonía aguda en intervalos de tiempo de máximo 8-12 hr. Vigile también el bienestar de los ratones infectados por observing su apariencia, comportamiento, y la determinación de la pérdida de peso.
- Anestesie ratones en la cámara de narcóticos del sistema de anestesia de los equipos de formación de imágenes antes de las mediciones en la cámara. Inicie la inhalación de una mezcla de isoflurano y oxígeno y esperar hasta que los ratones respirar lenta y regularmente.
- Coloque los animales anestesiados en la cámara de formación de imágenes del sistema y mantener los ratones en posición supina. La cámara CCD en la parte superior de la cámara A continuación, la imagen del tracto respiratorio murino.
- Coloca los animales con su nariz en los tubos para permitir la inhalación de los anestésicos.
- El isoflurano se permite la entrada en la cámara de formación de imágenes a través de una tubería de gas para mantener la anestesia.
- Para activar la cámara CCD en la parte superior de la cámara y empezar a imágenes ópticas bioluminiscente, pulse "Acquire" en el software de imágenes. Inmediatamente una fotografía de los ratones en la cámara cerrada aparece en la pantalla. Después de un minuto de la medición una superposición de los datos de la bioluminiscencia y la foto se muestra.
- Detener la anestesia después de que aparezca la superposición de imágenes en la ventana del programa y poner a los ratones de nuevo en sus jaulas.
- Los ratones son monitoreados para la recuperación.
Figura 2. Anestesia y seguimiento de los ratones infectados con neumococos bioluminiscente usando la anestesia IVIS y sistema de IVIS Spectrum, respectivamente. A) El sistema de IVIS Espectro de formación de imágenes. B) El sistema de anestesia de IVIS con la cámara de incubación. C) ratones anestesiados en la cámara de incubación . D) Ratones situado dentro de la cámara de IVIS Spectrum Imaging con la nariz inhalando el anestésico._blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
4. Cuantificación y Evaluación de la bioluminiscencia de los ratones infectados con S. bioluminiscente pneumoniae
- Determinar las intensidades de bioluminiscencia de los ratones o de una región seleccionada de los ratones mediante la cuantificación de la emisión de fotones total de (fotones / seg) usando el software de análisis de imagen.
- Utilice los valores de la emisión de fotones que se proporcionan en una hoja de datos de Excel para preparar un gráfico. Dado que la variación de los datos es a menudo alta dentro de los ratones agrupados, generar un gráfico cuadro de bigote para mostrar las diferencias en los ratones infectados con las diferentes cepas de neumococo.
- Proporcionar los fotones por ratones o como alternativa los resultados como el promedio de radiación (fotones / s / cm 2 / SR) de un área seleccionada.
- Los datos de medición de ROI (región de interés) en el modo de fotones pueden ser cuantitativamente diferente comparado a través de los sistemas de imágenes in vivo con diferentes vinoajustes ra, ya que las medidas en unidades de luminosidad toman en cuenta automáticamente los ajustes de la cámara (por ejemplo, tiempo de integración, hurgar en la basura, f / parada, y el campo de visión).
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Resultados
La adquisición y la absorción de la metionina es de importancia central para los neumococos a mantener la forma física en su nicho de acogida 32,33. La metionina ABC transportador de lipoproteína se codifica en D39 por el SPD _ 0151 genes (TIGR4: sp_0149) y nombró MetQ 32. Los neumococos producen más enzimas de la biosíntesis de la metionina (D39: Spd_0510 - Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 - Sp_0586, mete y metF). La falta de metionina en un medio químicamente definido afecta el ...
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Discusión
Todos los experimentos realizados en animales tienen que ser aprobados por las autoridades locales y las comisiones de ética. En experimentos in vivo de infección de la carga bacteriana en los diversos nichos de acogida de animales infectados tiene que ser determinada en diversos puntos temporales después de la infección. Bajo estas condiciones experimentales los animales tienen que ser sacrificados antes del aislamiento de las bacterias de la sangre, nasofaringe, lavado bronchoalvelar, o órganos tales co...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La investigación en el laboratorio fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) Genómica Médica Infección (FKZ 0315828A) a SH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Caldo Todd Hewitt | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | X936.1 | |
| Extracto de levadura | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | 2363.2 | |
| Placas de agar sangre | Oxoid, Wesel, Alemania | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | T832.2 | |
| Eritromicina | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Alemania | E6376 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Laboratorios PAA, Coelbe, Alemania | A11-151 | |
| Ratones CD-1, hembra | Charles River, Sulzfeld, Alemania | CD1SIFE06W08W | ratones CD-1 hembra, de seis a ocho semanas de edad |
| Ketamin 500 mg, solución inyectable Curamed | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Alemania | ||
| Rompun 2%, solución inyectable | Bayer Animal Health, Monheim, Alemania | ||
| BD Plastipak Jeringas de 1 ml | Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania | 300015 | estériles Jeringas Luer-Lok con aguja |
| Puntas de cargador de gel | PeqLab | 81-13790 | Mµ ltiFlex Tips |
| Hialuronidasa | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hialuronidasa Tipo IV-S de Bovine |
| test Oxygen | Air Liquide, Dü sseldorf, Alemania | M1001L50R2A001 | |
| Isoflurano | Baxter, Unterschleiß heim, Alemania | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Alemania | ||
| Oligonucleótidos | Eurofins MWG, Ebersberg, Alemania | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Alemania | 27104 | |
| kit de purificación de ADN PCR | Qiagen, Hilden, Alemania | 28106 | |
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemania | ||
| XGI-8 Calibre del sistema de anestesia de gas | Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemania | ||
| Sistema de imágenes del espectro IVIS | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Alemania | ||
| Biofotómetro | Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania |
Referencias
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