Las proteínas anticongelante (AFP) se unen a planos específicos de hielo para prevenir o retardar el crecimiento del hielo. El análisis de afinidad de plano de hielo basado en fluorescencia (FIPA) es una modificación del método original de grabado en hielo para la determinación de planos de hielo unidos a AFP. Las AFP están etiquetadas fluorescentemente, incorporadas en cristales de hielo macroscópicos individuales y visualizadas bajo luz UV.
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Artículo de método
La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia
En este artículo
Resumen
Resumen
Las proteínas anticongelante (AFP) se expresan en una variedad de organismos resistentes al frío para prevenir o retardar el crecimiento interno del hielo. Las AFP se unen a planos específicos de hielo a través de sus superficies de unión al hielo. El análisis de afinidad de plano de hielo basado en fluorescencia (FIPA) es una técnica modificada utilizada para determinar los planos de hielo a los que se unen las AFP. FIPA se basa en el método original de grabado en hielo para determinar los planos de hielo unidos a AFP. Produce imágenes más claras en un tiempo experimental acortado. En el análisis FIPA, las AFP se etiquetan fluorescentemente con una etiqueta quimérica o un tinte covalente y luego se incorporan lentamente en un solo cristal de hielo macroscópico, que ha sido preformado en un hemisferio y orientado para determinar los ejes a y c. El hemisferio de hielo unido a AFP se toma imágenes bajo luz UV para visualizar planos unidos a AFP utilizando filtros para bloquear la luz inespecífica. El etiquetado fluorescente de las AFP permite el monitoreo en tiempo real de la adsorción de AFP en el hielo. Se ha encontrado que las etiquetas no influyen en los planos a los que se unen las AFP. El análisis FIPA también introduce la opción de unir más de un AFP etiquetado de manera diferente en el mismo cristal de hielo para ayudar a diferenciar sus planos de unión. Estas aplicaciones de FIPA están ayudando a avanzar en nuestra comprensión de cómo las AFP se unen al hielo para detener su crecimiento y por qué muchos organismos productores de AFP expresan múltiples isoformas de AFP.
Introducción
La producción de proteínas anticongelante (AFP) es un importante mecanismo de supervivencia de algunos organismos que viven en ambientes cargados de hielo. Hasta hace poco, se pensaba que la única función de las AFP era prevenir o retardar el crecimiento de cristales de hielo internos que bloquearían la circulación, causarían daño tisular y estrés osmótico. Los organismos que no pueden tolerar ningún grado de congelación, como los peces, expresan AFP para inhibir completamente el crecimiento de cristales de hielo1. Otros, como la hierba, son tolerantes a la congelación y expresan AFP para inhibir la recristalización del hielo que reduce la formación de gran....
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Protocolo
1. Crecimiento de cristales de hielo individuales
- Tome una sartén de metal limpia (15 cm de diámetro, 4,5 cm de alto) que se ajuste a, y pueda flotar en, un baño de enfriamiento de etilenglicol.
- Preparar moldes cilíndricos de cloruro de polivinilo (PVC), (4,5 cm de diámetro, 3-4 cm de alto, 4 mm de espesor), aserrado de secciones de una tubería.
- Corte una muesca, (1 mm de ancho, 2 mm de alto) en un lado (Figura 1A).
- Preparar tantos moldes que puedan caber cómodamente en la sartén (Figura 1B).
Nota: Un estudio mostró que el alcohol polivinílico (ACV) puede afectar la nucleación del hielo22....
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Resultados
La preparación y el montaje del único cristal de hielo son los dos pasos del procedimiento FIPA donde los errores se comen con mayor frecuencia. La determinación de si el cristal de hielo preparado es único se realiza examinándolo a través de polaroids cruzadas (Figura 1D),como se describe en el paso 2.1 de la sección de protocolo. Si se utiliza un cristal de hielo multicristalino para el análisis FIPA, el resultado será la unión discontinua de las AFP en el hemisferio sin un patrón de unión coherente
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Discusión
El desarrollo del método de grabado en hielo por Charles Knight para la determinación de planos de hielo ligados a AFP avanzó enormemente los estudios sobre el mecanismo de unión de hielo por AFP. Mientras que las estructuras de las AFP podían resolverse mediante cristalografía de rayos X26,27, no existía un método obvio para deducir la superficie complementaria sobre hielo a la que se unían las AFP. Cuando se caracterizó inicialmente la AFP tipo I de la platija invernal, se planteó la hipótesis de que se unía.......
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Divulgaciones
No se declaran conflictos de intereses.
Agradecimientos
PLD ocupa la Cátedra de Investigación de Canadá en Ingeniería de Proteínas. Este trabajo fue financiado por una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud a PLD. Este trabajo también fue apoyado por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (No. 23310171) y de la Institución japonesa de avance de la investigación en tecnología bioorientada (BRAIN). Estamos agradecidos a los Dres. Chris Marshall y Mike Kuiper por el trabajo pionero que condujo a FIPA. También estamos agradecidos al Dr. Sakae Tsuda por proporcionar instalaciones para algunos de estos trabajos y a la Dra. Laurie Graham por configurar....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| NESLAB RTE Baño/Circuladores Refrigerantes | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Etilenglicol, Anticongelante/Refrigerante Premezclado | Certificado | 29-3037-0 | Anticongelante automotriz común |
| Dedo frío | no disponible | no disponible Hecho | a medida con latón (9 cm de largo, 1,5 cm de diámetro exterior) |
| Copa semiesférica | no disponible | no disponible | Hecho a medida con resina (8 cm de diámetro exterior, 6 cm de diámetro interior) |
| Sistema de iluminación de alta doble salida | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 voltios AC, LT-9470FX, LT-9549FX | pueden comprar filtros de excitación adicionales y personalizados en Lightools |
| Research Camera | Canon | EOS 50D | |
| Filtros de emisión | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Es posible que se requiera un adaptador de anillo de filtro para colocar el filtro en la lente de la cámara |
Referencias
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M.,
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Reimpresiones y permisos
