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Artículo de método

Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón

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DOI:

10.3791/51192

⸱

16 de mayo de 2014

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

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Resumen

Células DNabT son raros entre las células T periféricas; sin embargo, que son abundantes en ciertos tejidos no linfoides. Dificultad de aislar las células T DN de tejidos no linfoides dificulta su análisis funcional a pesar del aumento reconocida importancia fisiopatológica. Se describe un nuevo protocolo para el aislamiento de células DN T altamente purificadas de riñón murino.

Resumen

Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de los tejidos no linfoides a pesar de su participación cada vez informado en varias respuestas inmunes. Células DN T son un tipo de célula inmune única que ha sido implicado en la regulación de las respuestas y la tolerancia inmunes y autoinmunes a alotrasplantes 1-6. Células DN T son, sin embargo, rara en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y nódulos linfáticos), pero son importantes los residentes de la normal del riñón. Muy poco se sabe acerca de su función fisiopatológica 7 debido a su escasez en la periferia. Recientemente hemos descrito un análisis fenotípico y funcional integral de esta población en el riñón 8 en estado estacionario y durante la lesión por isquemia-reperfusión. Análisis de la función de las células T DN se verá muy reforzada por el desarrollo de un protocolo para su aislamiento del riñón.

Aquí, se describe un nuevo protocolo que permite isolation de alta pureza + CD8 + células T CD4 AB y las células DN T de riñón murino. En pocas palabras, digerimos tejido renal mediante colagenasa y aislar las células mononucleares de riñón (KMNC) por gradiente de densidad. Esto es seguido por dos pasos para enriquecer las células T hematopoyéticas de 3% a 70% de KMNC. El primer paso consiste en una selección positiva de las células hematopoyéticas CD45 + utilizando un kit de aislamiento. En el segundo paso, las células DN T se aíslan negativamente por la eliminación de células no deseadas utilizando CD4, CD8, MHC de clase II y anticuerpos monoclonales y CD1d α-GalCer tetrámero. Esta estrategia conduce a una población de más de 90% de pureza células T DN. Tinción de la superficie con los anticuerpos mencionados anteriormente, seguido por el análisis FACS se utiliza para confirmar la pureza.

Introducción

Periférico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doble negativa células (DN) T se dividen en varios subconjuntos que poseen fenotipos y funciones 1-4 distintos. DN células T, son poco conocidos, pero cada vez más implicados en la respuesta inmune fisiopatológicos en diferentes modelos de enfermedad 4-6.

Células DN T son un tipo de célula inmune única que está implicada cada vez más en la regulación de diversas respuestas inmunes y autoinmunes y la modulación de la tolerancia alotrasplante. 4-6, 9 son raros en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y los ganglios linfáticos ). Sin embargo, son importantes los residentes del riñón y el intestino epitelio normal 10-12. Muy poco se sabe acerca de su función 7 en el riñón en el estado estacionario y en condiciones patológicas como la lesión renal aguda (LRA) asociado con trasplantación de riñónhormiga.

Debido a las funciones complejas de diferentes células inmunes en la regulación de respuestas inmunes incluyendo alloresponses, definir el papel de cada jugador es fundamental para entender alloresponses y el diseño de nuevas terapias. Teniendo en cuenta los números significativos de células DN T presentes en el riñón bajo condiciones fisiológicas y de enfermedad diferentes, las células DN T es probable que desempeñen un papel crítico en la regulación de respuestas inmunes y autoinmunes en ratones y seres humanos, y alloresponses en receptores de trasplante. La acumulación de pruebas, aunque todavía dispersos implica células T DN en ambas funciones patogénicas e inmunosupresores, pero no se comprende bien por qué y cómo se exhiben una función perjudicial o supresora específica y cómo el ambiente influye en ellos.

Debido a su baja abundancia en el riñón, mejora de los métodos de aislamiento son necesarios.

Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de Tél tejidos no linfoides. Nuestro protocolo describe un nuevo método para el aislamiento de células DN T de los riñones; Sin embargo, el método también se puede utilizar para diversos tejidos no linfoides.

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Protocolo

1. Preparación de los instrumentos, los medios de cultivo y reactivos

  1. Instrumentos: Preparar los reactivos en condiciones estériles y utilizar bajo una campana de flujo laminar.
  2. Preparar 1 L de medio de cultivo tisular RPMI, añadir 5% de suero fetal bovino, 2,1 g de bicarbonato, 10 ml de glutamato 100x, 10 mg de HEPES, piruvato de sodio 1 mg y 10 ml de 100X penicilina / estreptomicina.
    Nota: el medio de cultivo tisular recomendada, RPMI, es intercambiable con DMEM.
  3. Preparar la solución de 5% de colagenasa "D" (5 ml de colagenasa "D" a 9 ml de medio de cultivo tisular).
  4. Hacer solución de Percoll a tres concentraciones diferentes: 100%, 80% y 40%. Las siguientes concentraciones se calculan para 1 muestra. Mantenga las soluciones a temperatura ambiente.
    1. Solución de Percoll: añadir 9 ml de Percoll (sin diluir de solución madre); añadir 1 ml de PBS 10x.
    2. Solución de Percoll: añadir 8 ml de Percoll 100%; añadir 2 ml de PBS 1x.
    3. Solución de Percoll:añadir 4 ml de Percoll al 80%; añadir 4 ml de PBS 1x.
  5. Hacer 1 L de fluorescencia de células activadas por la clasificación tampón (FACS); añadir 5 ml de 10% de BSA (BSA al 0,1%), azida de sodio 1 ml al 10% (0,1%), 2 ml de agente EDTA, completar a 1 000 ml con PBS 1x.

2. Preparación de la digestión de riñón

  1. Habiendo adquirido cualquier aprobación institucional necesario, sacrifica y Exsanguinate los ratones con los métodos estándar y siguiendo las normas vigentes y las directrices de cuidado de animales.
    1. Se anestesia el ratón con pentobarbital (0,07 mg / kg).
    2. Continúe con el desangramiento.
    3. Coloque el ratón en una posición supina sobre una mesa quirúrgica.
    4. Pulverizar la zona abdominal con etanol al 70%.
  2. Añadir 10 ml de solución de colagenasa D para la placa de Petri.
  3. Retire y decapsulate ambos riñones de cada ratón.
    1. Abra la cavidad abdomimal haciendo una incisión en la línea media a través de la piel abdominal y el peritoneo desde el esternón hastael pubis.
    2. Exponer el riñón izquierdo moviendo el intestino lateralmente a un lado.
    3. Separe con cuidado la cápsula a la izquierda con las pinzas.
      Nota: La cápsula aparece como una capa transparente que rodea el riñón y parcialmente cubierto por el tejido adiposo perirrenal.
    4. Retire el riñón izquierdo cortando los vasos del pedículo utilizando una tijera quirúrgica.
    5. Repita mismo procedimiento para el riñón derecho.
      Nota: El riñón derecho es más craneal y más cerca de la línea media (pedicelos son más cortos).
  4. Coloque el riñón en la placa de Petri.
  5. Cortar el tejido renal en trozos pequeños (1-2 mm de dimensión) usando una cuchilla regular de la conformación de metales y colocar las piezas en la solución de colagenasa durante 30-45 minutos en la incubadora a 37 ° C (Figura 1).

3. Preparación de las células mononucleares de riñón (KMNC) de la digestión del Riñón

  1. Obtener una suspensión de células del riñónla digestión mediante la interrupción mecánicamente el tejido usando un filtro (70 micras) y se resuspende en 25 ml de medio de cultivo tisular y mezclar.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 º C para sedimentar la suspensión de células.
  3. Vuelva a suspender el sedimento en 4 ml de solución de Percoll 40% y suavemente superponer en 4 ml de solución de Percoll al 80% con una pipeta de plástico de transferencia, muy despacio y con cuidado. Esto dará como resultado dos fases claramente separadas por una capa translúcida. En la parte superior será una capa de color amarillo que corresponde a los lípidos.
  4. Se centrifuga a 1500 × g durante 30 min a temperatura ambiente con la centrífuga en el modo de freno.
  5. Quite por aspiración de la capa superior de color amarillo y grueso (unos 1-2 ml).
  6. Recoger sólo la capa translúcida de color blanquecino ligero de la interfase de las dos fases con una pipeta de transferencia. De transferencia muy cuidadosamente esta suspensión en un tubo cónico de 15 ml que contiene 2 ml de medio de cultivo tisular y a continuación, añadir 13 ml de medio para hacer un volumen total de15 ml.
  7. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C.
  8. Resuspender las muestras en 1 ml del medio.
  9. Cuente el número de KMNC mediante exclusión con azul de tripano en un hemocitómetro y expresar los resultados como números de KMNC por ml por cada riñón.
  10. Lavar una vez que el anterior.

4. Aislamiento de hematopoyéticas (CD45 +) las células de KMNC (Paso I)

  1. Resuspender las células a 10 7 a 90 l de tampón.
  2. Añadir 10 l de microperlas CD45 y se incuba durante 15 min a 4 ° C.
  3. Añadir 1 ml de tampón de desarrollo para detener la reacción. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 500 l de tampón de ejecución.
  4. Preparar la columna magnética colocando en el imán y enjuague con 3 ml de tampón.
  5. Pasar la suspensión de células a través de la columna magnética y recoger las células no marcadas que pasan a través de la columna.
  6. Lavar las células tres veces con 3 ml de runnción tampón. Luego recoger el efluente.
  7. Retire la columna del separador y una pipeta 5 ml de tampón en las columnas y enjuagar la fracción marcada inmediatamente. Esta fracción contiene las células CD45 +. Contar las células.
  8. Para calcular el número absoluto de diferentes subconjuntos de células T en los riñones multiplicar el número total de KMNC por el porcentaje de células positivas determinado por citometría de flujo (Figura 2).

5. Aislamiento de DN T Móvil desde CD45 + Preparación por selección negativa (Etapa II)

  1. Añadir 2,5 l (0,5 mg / ml, 1,25 microgramos) de cada uno de los siguientes anticuerpos biotinilados anti-CD4, anti-CD8, anti-receptor de Fc (CD16/32), anti-MHC de clase II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetrámero por cada 10 células hematopoyéticas 7.
  2. Se incuban las células durante 30 min en la habitación fría.
  3. Añadir 1 microperlas anti-biotina ml.
  4. Incubar durante 30 minutos en una cámara frigorífica.
  5. Colocar el tubo en tél imán y proceder al agotamiento.
  6. Contar las células viables para determinar el número total de células DN T en la fracción negativa mediante el uso de un hemocitómetro.
  7. Compruebe la pureza de las células T DN con citometría de flujo, siguiendo esta estrategia gating: primero CD45 + puerta, segunda puerta TCRαβ +. Excluir las células CD1d +. Parcela CD4 + CD8 + vs Para identificar las células DN T (Figura 3).
  8. Multiplique el número total por el porcentaje determinado en la pureza.
    Nota: El uso de este protocolo resulta en una población de más de 90% de pureza células T DN.

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Resultados

Tipo salvaje C57BL / 6 (B6) riñón contiene aproximadamente 1.5 a 2.1 x 10 6 células mononucleares por el riñón. Aproximadamente menos de 10% son células hematopoyéticas CD45 +. Para la preparación de células mononucleares de riñón (KMNC), los riñones se cortan en trozos pequeños, como se muestra en la Figura 1 seguido por la digestión usando 5% de colagenasa.

Esto es seguido por la realización de una centrifugación en gradiente de densidad para recoger ...

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Discusión

Existe un interés creciente en las células T DN ya que están siendo implicados en diferentes condiciones patológicas tales como enfermedades autoinmunes, el cáncer, la tolerancia del injerto, y las enfermedades primarias del riñón incluyendo lesión renal aguda (LRA), glomerulonefritis 8, 13. Por lo tanto, no hay necesidad de entender mejor y caracterizar las funciones fisiopatológicas de las células T DN. Sin embargo, actualmente hay una falta de comprensión de la función de estas células en comparación con C...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por el NIH PBS (R21 AI095484). Damos las gracias a instalaciones básicas tetrámero NHI para CD1d tetrámero.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Campana de flujo laminar Baker Company, IncO equipo equivalente 
CentrífugaBeckman Coultero equipo equivalente 
HemocitómetroElectrónica Microscopy Sciences63514-11
Incubadora de atmósfera controladaFisher Scientific ( 37 y s° C con 5% de CO2)
Citómetro de flujo analíticoLSR II
RPMI 1640Media Tech10-040-CV
Colagenasa DRoche11088858001
Percoll GE Healthcare17-0891-01
Suero fetal bovino Corning Cellgro35-011-CV
0,1% azida de sodio (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Tampón de fosfato tamponado salino (PBS)Corning Cellgro21-040-CV
PBS 10xMediatech46-013-CM
Tampón EDTA Sigma-AldrichE1161
LS columnas MiltenyiBiotec130-042-401
CD45+ microperlasMiltenyiBiotec6.78E-51
Microperlas de biotina MiltenyiBiotec130-090-485
anti-CD45 (clon: 30-F11)  PerCP eBioscienceG1397
anti-CD45 (clon: 30-F11)  APC-Cy7Biolegend103116
anti-TCR Pacific Blue  (cadena ab, clon: H57-597)InvitrogenHM3628
anti-CD4 PEeBioscience12-0043
anti-CD8 FITCeBioscience8011-0087
anti-CD4 biotinilado (GK1.5)BD553728
biotinilado anti-CD8  (clon 53-6.7)BD553029
anti-MHC clase II (I-A b) BD biotinilado553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer MIlteny I Biotec130-091-221
C57BL/6JJackson Labs000664Riñones - Placa de Petri de Ganglios Linfáticos
 BD Biociencias356517
70 μ Filtro M Émbolode 22363548
Scientific O equipo equivalente 
Tubos GeneMate 50 mlBioexpressC-3394-3O equipo equivalente 
Tubos GeneMate 15 mlBioexpressC-3394-1O equipo equivalente 
CD1d α-tetrámero galcerNHI
ratones Fisher

Referencias

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  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
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  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
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  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

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Reimpresiones y permisos

Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

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