Células DNabT son raros entre las células T periféricas; sin embargo, que son abundantes en ciertos tejidos no linfoides. Dificultad de aislar las células T DN de tejidos no linfoides dificulta su análisis funcional a pesar del aumento reconocida importancia fisiopatológica. Se describe un nuevo protocolo para el aislamiento de células DN T altamente purificadas de riñón murino.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón
En este artículo
Aviso de erratum
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Resumen
Resumen
Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de los tejidos no linfoides a pesar de su participación cada vez informado en varias respuestas inmunes. Células DN T son un tipo de célula inmune única que ha sido implicado en la regulación de las respuestas y la tolerancia inmunes y autoinmunes a alotrasplantes 1-6. Células DN T son, sin embargo, rara en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y nódulos linfáticos), pero son importantes los residentes de la normal del riñón. Muy poco se sabe acerca de su función fisiopatológica 7 debido a su escasez en la periferia. Recientemente hemos descrito un análisis fenotípico y funcional integral de esta población en el riñón 8 en estado estacionario y durante la lesión por isquemia-reperfusión. Análisis de la función de las células T DN se verá muy reforzada por el desarrollo de un protocolo para su aislamiento del riñón.
Aquí, se describe un nuevo protocolo que permite isolation de alta pureza + CD8 + células T CD4 AB y las células DN T de riñón murino. En pocas palabras, digerimos tejido renal mediante colagenasa y aislar las células mononucleares de riñón (KMNC) por gradiente de densidad. Esto es seguido por dos pasos para enriquecer las células T hematopoyéticas de 3% a 70% de KMNC. El primer paso consiste en una selección positiva de las células hematopoyéticas CD45 + utilizando un kit de aislamiento. En el segundo paso, las células DN T se aíslan negativamente por la eliminación de células no deseadas utilizando CD4, CD8, MHC de clase II y anticuerpos monoclonales y CD1d α-GalCer tetrámero. Esta estrategia conduce a una población de más de 90% de pureza células T DN. Tinción de la superficie con los anticuerpos mencionados anteriormente, seguido por el análisis FACS se utiliza para confirmar la pureza.
Introducción
Periférico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doble negativa células (DN) T se dividen en varios subconjuntos que poseen fenotipos y funciones 1-4 distintos. DN células T, son poco conocidos, pero cada vez más implicados en la respuesta inmune fisiopatológicos en diferentes modelos de enfermedad 4-6.
Células DN T son un tipo de célula inmune única que está implicada cada vez más en la regulación de diversas respuestas inmunes y autoinmunes y la modulación de la tolerancia alotrasplante. 4-6, 9 son raros en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y los g....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de los instrumentos, los medios de cultivo y reactivos
- Instrumentos: Preparar los reactivos en condiciones estériles y utilizar bajo una campana de flujo laminar.
- Preparar 1 L de medio de cultivo tisular RPMI, añadir 5% de suero fetal bovino, 2,1 g de bicarbonato, 10 ml de glutamato 100x, 10 mg de HEPES, piruvato de sodio 1 mg y 10 ml de 100X penicilina / estreptomicina.
Nota: el medio de cultivo tisular recomendada, RPMI, es intercambiable con DMEM. - Preparar la solución de 5% de colagenasa "D" (5 ml de colagenasa "D" a 9 ml de medio de cultivo tisular).
- Hacer solución de Percoll a tres concentraciones di....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Tipo salvaje C57BL / 6 (B6) riñón contiene aproximadamente 1.5 a 2.1 x 10 6 células mononucleares por el riñón. Aproximadamente menos de 10% son células hematopoyéticas CD45 +. Para la preparación de células mononucleares de riñón (KMNC), los riñones se cortan en trozos pequeños, como se muestra en la Figura 1 seguido por la digestión usando 5% de colagenasa.
Esto es seguido por la realización de una centrifugación en gradiente de densidad para recoger .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Existe un interés creciente en las células T DN ya que están siendo implicados en diferentes condiciones patológicas tales como enfermedades autoinmunes, el cáncer, la tolerancia del injerto, y las enfermedades primarias del riñón incluyendo lesión renal aguda (LRA), glomerulonefritis 8, 13. Por lo tanto, no hay necesidad de entender mejor y caracterizar las funciones fisiopatológicas de las células T DN. Sin embargo, actualmente hay una falta de comprensión de la función de estas células en comparación con C.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por el NIH PBS (R21 AI095484). Damos las gracias a instalaciones básicas tetrámero NHI para CD1d tetrámero.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Campana de flujo laminar | Baker Company, Inc | O equipo equivalente | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | o equipo equivalente | |
| Hemocitómetro | Electrónica Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Incubadora de atmósfera controlada | Fisher Scientific | ( 37 y s° C con 5% de CO2) | |
| Citómetro de flujo analítico | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Colagenasa D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Suero fetal bovino | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0,1% azida de sodio (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Tampón de fosfato tamponado salino (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| Tampón EDTA | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columnas | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microperlas | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Microperlas de biotina | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clon: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clon: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (cadena ab, clon: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinilado (GK1.5) | BD | 553728 | |
| biotinilado anti-CD8 (clon 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-MHC clase II (I-A b) BD biotinilado | 553609 | ||
| AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J | Jackson Labs | 000664 | Riñones - Placa de Petri de Ganglios Linfáticos |
| BD Biociencias | 356517 | ||
| 70 μ Filtro M | Émbolo | de 22363548 | |
| Scientific | O equipo equivalente | ||
| Tubos GeneMate 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | O equipo equivalente |
| Tubos GeneMate 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | O equipo equivalente |
| CD1d α-tetrámero galcer | NHI |
Referencias
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
