Gránulos de estrés (SGS) son gránulos de ARN citoplásmicos que contienen partículas estancadas ribonucleoprotein (RNPs), y importante en la respuesta celular a varios tipos de estrés. Dinámica de SGS puede seguirse en células vivas mediante la visualización de la localización de un componente de etiquetado de SGS en células primarias transfectadas después de estrés.
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Artículo de método
Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo
En este artículo
Resumen
Resumen
SGS puede ser visualizado en las células mediante inmunotinción de los componentes específicos de la proteína o ARNm poliA +. SG son muy dinámicos y el estudio de su montaje y el destino es importante entender la respuesta celular al estrés. La deficiencia en los factores clave de la SG como G3BP (RasGAP dominio SH3 unión a proteínas) da lugar a defectos en el desarrollo en ratones y alteraciones del sistema nervioso central. Para el estudio de la dinámica de la SG en las células de un organismo, uno puede células primarias de cultivo y seguir la localización de un componente etiquetado transfectadas de SGS. Se describe el experimento de lapso de tiempo para observar SGS contiene G3BP1 en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). Esta técnica también se puede utilizar para estudiar SG que contiene G3BP en las neuronas en vivo, que es crucial, ya que ha demostrado recientemente que estas SG se forman en la aparición de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer. Este enfoque puede ser adaptado a cualquier otro cuerpo celular y proteína de los gránulos de componentes, y lleva a cabocon animales transgénicos, lo que permite el estudio directo de la dinámica de gránulos, por ejemplo, en la ausencia de un factor específico de estos gránulos.
Introducción
Gránulos de estrés (SGS) son focos citoplásmica no membranosa formada como una respuesta protectora celular al estrés ambiental, tal como temperatura elevada, el estrés oxidativo, la hipoxia, choque osmótico, la irradiación UV, la privación de glucosa, o infección viral 1. Ellos pueden ser inducidas químicamente por tratamiento con compuestos como el arsenito de sodio, lo que provoca el estrés oxidativo. SG acumulan estancado traducción detenido ribonucleoproteína mensajero (mRNPs) Complejos de 2, el secuestro de ARNm a partir de la maquinaria de traducción, y su montaje puede ser desencadenada por la fosforilación de eIF2α (factor de iniciación....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales en este protocolo son, en estricto apego a las directrices de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea de 24 de noviembre de 1986 (86-609/EEC). La casa de los ratones del grupo, permitiendo que los alimentos y el agua ad libitum. Mantener en un ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de humedad) con un 12 hr: 12 horas de luz: oscuridad ciclo (la luz a las 7:00 de la mañana).
1 Cultura de células murinas primarias:. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
- Autoclave pinzas delgadas, así como pinzas curvas y tijeras de disección. Almacene en un recipiente estéril. Utilice e....
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Resultados
La formación de estrés gránulo es importante en la respuesta de las células al estrés, lo que permite una adaptación celular con traducción estancado, hasta que la tensión ha despejado, asociado a la prevención de la apoptosis. Permisos de este ensayo para estudiar los SG en células primarias, siguiendo la localización de los componentes clave de proteínas SGs (Figura 1). G3BP, un factor clave de reunión SG, está presente en lugar de modo difuso en el citoplasma de neuronas o MEFs (Figura 2A A
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Discusión
Los pasos más importantes en el Protocolo se refieren a la transfección y más particularmente las adquisiciones de lapso de tiempo, que tienen que ser cuidadosamente monitoreados para bajar abajo de la citotoxicidad.
Cultivo de células primarias no es una parte difícil, siempre y cuando se mantengan las condiciones estériles y la precaución se toma con el fin de evitar daños durante las etapas de disección y disociación celular. MEFs se puede mantener congelado a principios de los pasajes. T.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer la plataforma Montpellier Rio Imaging (MRI) en la que se realizaron las adquisiciones. Agradecen a Isabel Cristina López Mejía, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot y Virginie Georget por su ayuda en diferentes partes del protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Precalentamiento a 37 ° C |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360 | |
| Aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030 | |
| Tripsina | Gibco | 15096 | |
| Fondo de vidrio B-35 | Greiner | 627860/627861 | Tratados o no (tratados: aumentan la adhesión de las células adherentes) |
| Poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Precalentamiento a 37 ° C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Precalentamiento a 37 &° C |
| 2-mercaptoetanol | Gibco | 31350 | |
| Pinzas | Biotek | DU-110-A | Muy finas, puntas de 0,1 mm (útiles para eliminar las meninges) |
| Pinzas curvas | Biotek | P-110-BUF | Muy finas, puntas de 0,1 mm |
| Tijeras pequeñas | Biotek | CM-85-BS | Puede ser útil para eliminar los hipocampos |
| Transfección Polyplus Reactivo JetPEI | Transfección Ozyme | 101-10 | MEFs, siga el protocolo de avance |
| Microscopio confocal de barrido láser invertido | Leica | SP5 |
Referencias
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and trans....
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Reimpresiones y permisos
