Capsular serotipificación de Streptococcus pneumoniae Uso de la Reacción Quellung

Resumen

La reacción de Quellung es la técnica estándar de oro para la serotipificación Streptococcus pneumoniae. Esta técnica utiliza un microscopio y antisueros neumocócica específica y se utiliza comúnmente en referencia y laboratorios de investigación en todo el mundo.

Resumen

Hay más de 90 diferentes serotipos capsulares de Streptococcus pneumoniae (neumococo). Además de ser una herramienta para la comprensión de la epidemiología de neumococo, serotipificación capsular puede proporcionar información útil para los estudios de eficacia y de impacto de la vacuna. La reacción de Quellung es el método estándar de oro para la serotipificación capsular de neumococo. El método implica la evaluación de una suspensión celular neumocócica con antisueros agrupada y específica dirigida contra el polisacárido capsular. Las reacciones antígeno-anticuerpo se observan microscópicamente. El protocolo tiene tres pasos principales: 1) Preparación de una suspensión de células bacterianas, 2) de mezcla de células y antisuero sobre un portaobjetos de vidrio, y 3) la lectura de la reacción de Quellung usando un microscopio. La reacción de Quellung es razonablemente fácil de realizar y se puede aplicar siempre que sea un microscopio y antisueros adecuados están disponibles.

Introducción

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es responsable de la muerte de unos 800.000 niños menores de cinco años anualmente, con la carga de morbilidad que pesa sobre todo en los países con pocos recursos ^1. Las enfermedades neumocócicas varían en gravedad de las infecciones localizadas como la otitis media aguda a las infecciones que amenazan la vida graves como sepsis, meningitis y neumonía ^2. ¡Más de 90 serotipos capsulares de neumococos se han descrito ^{3, 4.} Vacunas neumocócicas actuales proporcionan protección contra los serotipos que son responsables de la mayoría de la enfermedad invasiva ^{5, 6.} Sin embargo, el uso generalizado de las vacunas se ha asociado con el reemplazo de serotipos incluidos en la vacuna por los serotipos no vacunales, tanto en el transporte nasofaríngeo y enfermedad invasiva ^{7, 8.} Esto pone de relieve la importancia de la serotipificación por epidemiológicala vigilancia y el impacto de la vacuna a largo plazo estudia ^9.

El método estándar de oro para la tipificación neumocócica es la prueba de reacción capsular, conocido como la reacción de Quellung, primero descrita por Neufeld en 1902 (ver austriaca ^10). Se ha encontrado un alto grado de concordancia entre los laboratorios y entre la reacción Quellung y otros métodos de serotipificación ^11-13. Existen diversas variaciones de la reacción de Quellung ^{10, 14-16.} El método descrito aquí no requiere el uso de una mancha de venta libre o la lente de inmersión en aceite; más bien, una gota de muestra preparada es mezclada con el suero de escribir y examinó inmediatamente bajo un aumento de 400X.

La reacción de Quellung se realiza generalmente utilizando antisueros disponibles comercialmente. El método descrito aquí usa menos antisueros en comparación con algunos otros métodos ^{16, 17,} por lo que es más rentable. Una vez que un aisladorcomió se identifica como el neumococo, se secuencialmente probado con piscinas antisueros hasta que se observa una reacción positiva. Cada antisuero piscina contiene diferentes mezclas de antisueros producidos contra 91 serotipos de neumococo ^18. Una vez establecida la piscina, el tipo individual y del grupo de antisueros que se incluyen en el grupo reactivo se prueban individualmente en secuencia. Tipo antisueros generalmente reaccionan con un solo serotipo (por ejemplo, tipo 1 antisuero reacciona con el serotipo 1), mientras que los antisueros de grupo reaccionan con todos los serotipos de un grupo en particular (por ejemplo, el Grupo 22 antisuero reacciona con los serotipos 22F y 22A). Algunos serotipos dentro de los grupos se diferencian adicionalmente usando antisueros de los factores (por ejemplo, el serotipo 22F reacciona con el factor 22b, pero no 22c). En este caso la prueba se continuó con todos los antisueros factor relevante hasta que se determina el serotipo ^{19, 20.} La reacción de Quellung es simple y rápida ¹⁴ y se puede realizar en cualquier laboratory que está equipado con un microscopio de buena calidad y conjunto apropiado de antisueros.

Protocolo

1. Preparación de la suspensión celular para la tipificación

1. El uso de un bucle de 1 l desechable estéril, tomar un pequeño barrido de fresco durante la noche cultivo puro de neumococos crecido en agar sangre de caballo no selectivo sólido e inocular 100 l Heart Infusion (HI) de caldo. La suspensión debe aparecer ser apenas visiblemente turbia. Agitar suavemente el tubo para emulsionar.
   Nota: otros medios, como el caldo de infusión cerebro corazón también pueden ser adecuados. La adición de suero (por ejemplo, una concentración final de 10% (v / v) de suero de caballo) y una incubación a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora antes de su uso se puede usar para mejorar la reacción.

2. Comprobación de la densidad de la suspensión celular

La suspensión celular preparada en la etapa 1.1 también se utilizará como control negativo, y se debe comprobar para densidad celular antes de añadir los sueros a escribir.

1. El uso de un bucle de 1 l, transferir una gota de inóculo preparado en la etapa 1.1 en un vasodiapositiva s microscopio.
2. Con un par de pinzas, coloque una pequeña cubreobjetos circular sobre la suspensión.
3. Usando ajuste de contraste de fase, observar la preparación al microscopio bajo magnificación 400X, para comprobar la densidad de la suspensión (Figura 1A).
   1. Si el inóculo es demasiado pesada (Figura 2A), añadir más caldo a la suspensión de células realizado en el paso 1.1 para diluirlo. Mezcle suavemente de nuevo.
   2. Si el inóculo es demasiado clara, por ejemplo, hay <50 células visibles en el campo microscópico (Figura 2B), añadir más bacterias a la preparación de la suspensión de células realizado en el paso 1.1 y mezclar suavemente.
      Nota: Con la experiencia, la densidad de la suspensión de células se puede juzgar por agitación y sosteniendo a la luz, en el que debe aparecer ser simplemente visiblemente turbia.
4. Repetir los pasos 2.1 a 2.3 hasta que un número adecuado de células son visibles en el campo microscópico.
   Nota: diapositivas y coversl Vidrioips presentan un peligro de objetos punzantes. Después de su uso, diapositivas y cubreobjetos están contaminados con material infeccioso y deben desecharse en un recipiente previsto.

3. Mecanografía

1. Transferencia ~ 1 l del inóculo preparado (por ejemplo, utilizando un bucle de 1 l) sobre el portaobjetos de microscopio de vidrio. Tire el asa en el recipiente previsto.
2. Añadir un volumen igual (1 l asa) del antisuero a temperatura ambiente en la diapositiva y mezclar dos gotas de bien con el bucle.
3. Con un par de pinzas, coloque una pequeña cubreobjetos circular sobre la suspensión, teniendo cuidado de no tocar la gota. Coloque el cubreobjetos sobre la suspensión inmediatamente después de la adición de antisueros para evitar que el fluido en la diapositiva de la desecación.
4. Usando un microscopio, observar la suspensión bajo contraste de fase con una ampliación de 400X. Se observa una reacción negativa Quellung cuando poco o nada de 'hinchazón' de las células neumocócicas pueden verse en 40Magnificación 0X, similar a lo que se observa en la suspensión celular neumocócica sin antisueros añadió (control negativo). Se observa una reacción positiva de Quellung cuando las células aparecen ampliada o "hinchado" y más visible cuando se compara con las células en el control negativo.
   Nota: reacciones dudosos deberán investigarse más a fondo, por ejemplo mediante el examen de la reacción después de 5-10 minutos de incubación a temperatura ambiente, o mediante la repetición de la reacción con antisuero más.
5. Realizar la serotipificación neumocócica con pruebas sucesivas de piscinas antisueros individuales hasta que se observa una reacción positiva. Alternativamente, las piscinas se pueden aplicar en 'rondas', dependiendo de la incidencia local de la serotipos.
   Nota: Las pruebas en "rounds" asegura que las piscinas que contienen anticuerpos contra los serotipos más comunes se prueban primero, minimizando el esfuerzo y el costo. Ensayo simultáneo de varias piscinas también proporciona controles negativos adicionales, que puede ser útil en interpretation. Si todas las piscinas en un 'round' particular, son negativos, probar el aislamiento con las siguientes rondas de piscinas.
6. Pruebe el aislado utilizando el tipo apropiado o antisuero grupo contenida dentro de la piscina reactiva. En su caso, utilizar factor de antisueros para diferenciar aún más el serotipo.
   Nota: Claves para antisueros neumocócica suministrados por el fabricante se utilizan en la selección de la piscina, el tipo y grupo o factor de antisueros y la interpretación de los resultados (incluidas posibles reacciones cruzadas).
7. Si se obtienen resultados negativos con todas las piscinas, probar el aislamiento con el reactivo Omniserum (contiene anticuerpos contra 91 serotipos ^21). Si todavía no se observa una reacción positiva de Quellung cuando se prueba un neumocócica aislar con el reactivo Omniserum, esto puede ser debido a que el aislamiento está expresando poca o ninguna cápsula, o que los anticuerpos contra el serotipo no están representados en la Omniserum. Esta última categoría puede incluir nuevos serotipos.

Resultados

Una reacción positiva de Quellung se produce cuando anticuerpos de tipo específico se une a la cápsula del neumococo, que conduce a un cambio en su índice de refracción ^10. Cuando se observa bajo un microscopio, las bacterias parecen 'hinchada' y más visible ^14. Figura 1A muestra células neumocócicas en caldo de HI. Cuando se añade antisuero de tipo específico a la suspensión bacteriana, neumococos aparece 'hinchada', de refracción y más redondeada (Figura 1B).

Demasiados células bacterianas añadidas al caldo puede dar lugar a la agregación de las células o una reacción falsa negativa. Figura 2 muestra inóculos de células neumocócicas en caldo HI que son "demasiado pesado" (Figura 2) o 'demasiado ligero' (Figura 2B).

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Figura 1. Reacción negativa y positiva de Quellung. Preparaciones de serotipo 9V neumocócica aislar sin antisuero (1A) y con el grupo 9 antisuero (1B), se observa bajo una ampliación de 400X. Este último muestra la 'inflamación' y el redondeo de las células bacterianas típicamente visto en una reacción positiva de Quellung.

Figura 2. Inóculos demasiado pesada y demasiado clara. Preparaciones de suspensiones celulares de neumococo que son demasiado pesados ​​(2A) o demasiado clara (2B), cuando se utiliza con una ampliación de 400X.

Discusión

Un paso crítico en esta técnica es asegurar un cultivo puro se utiliza para preparar la suspensión junto con la adición de un número adecuado de células bacterianas al caldo. Cabe señalar que el crecimiento de colonias y la morfología en placas de agar varía entre diferentes aislamientos de neumococos. Algunas producen colonias seca y áspera, que pueden ser difíciles de recoger con un bucle y no emulsionar bien en el caldo. Por esta razón, un barrido más grande de las bacterias puede ser necesaria cuando la preparación de la suspensión de células. En cualquier caso, es imperativo que las células individuales, y no agregados, son evidentes en el control negativo de modo que su tamaño relativo se puede comparar con las células con antisueros añadido. Además, demasiadas células bacterianas pueden resultar en una reacción negativa falsa, donde un exceso de antígeno capsular puede inhibir la reacción de Quellung ^10. Por esta razón, es importante para crear una suspensión bacteriana con una densidad celular apropiada (Figura 1). El SUSpensión se puede conservar durante varios meses mediante la adición de varias gotas de formalina concentrada. Esto permite pruebas de lotes más fácil y también esteriliza el caldo de reducir el riesgo de infecciones adquiridas en el laboratorio, aunque esto debe sopesarse frente a los riesgos de seguridad de la manipulación de formalina, que es tóxico, corrosivo, cancerígeno, sensibilizante, e inflamable. Además, hemos observado que algunos aislados muestran reacciones más débiles en la presencia de formalina (datos no mostrados).

Reacciones de Quellung se examinaron usando un microscopio. El uso de contraste de fase mejora la visibilidad de la cápsula. En algunos laboratorios, la reacción se ve mediante inmersión en aceite a 1000 x Ampliación ^{14, 16.} Además, algunos laboratorios utilizan una mancha contador (azul de metileno) para mejorar aún más la visibilidad de una reacción positiva ^{10, 16, 22.} El método que aquí se presenta es visto sin aceite-immersion y bajo una ampliación de 400X ^{15, 17.} Este método es rápido, sencillo y relativamente fácil de leer ^23.

Es importante mantener buenos procedimientos de control interno de la calidad para asegurar los procedimientos de antisueros y pruebas están en orden. La participación en un programa de garantía de calidad externa a menudo es beneficioso.

Una limitación importante de la reacción de Quellung por el serotipado de neumococos es el alto costo de los antisueros requerido. Sin embargo, esto se reduce al mínimo en el protocolo anterior debido a la pequeña cantidad de antisuero usado para cada reacción. Varios otros métodos han sido descritos para la serotipificación neumococos ^{23, 24.} Sin embargo, de Quellung sigue siendo el estándar de oro y el desarrollo de nuevos métodos requiere la normalización en contra de la reacción de Quellung ^23. Utilizando antisueros adecuados, la reacción de Quellung también puede ser utilizado para identificar y escriba otras tapasUle la producción de bacterias ^25. La reacción Quellung es fundamental en la caracterización de los serotipos de neumococo actuales y emergentes, así como proporcionar información sobre la eficacia de la vacuna y el impacto a largo plazo de la vacunación en el carro y la enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Neumococo (Neufeld) antisueros	SSI Diagnostica		http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Lleve todos los antisueros a temperatura ambiente antes de usar
Pneumococo (Omni) antisuero	SSI Diagnostica	2438	Lleve todos los antisueros a temperatura ambiente antes de usar
Microscopio óptico	Leica Microsystems
1 µ l	Copán	CD175S01
placas de agar sangre de caballo (HBA)	Thermo Fisher Scientific	PP2001	http://www.thermofisher.com.au/ Llevar a temperatura ambiente antes de usar
Caldo de infusión cardíaca (HI)	Unidad de preparación de medios (MPU), Universidad de Melbourne	40HIN	Llevar a temperatura ambiente antes de usar
Portaobjetos de microscopio de vidrio 76 mm x 26 mm	Lomb Scientific	7101	Peligro de objetos punzantes: Deséchelo en un contenedor de objetos punzocortantes de riesgo biológico
Cubreobjetos de vidrio circulares	NeuVitro	GG-5
*Excluyendo los antisueros, todos los demás materiales se pueden comprar a proveedores
*Las placas preparadas con sangre de oveja desfibrada son adecuadas, pero las placas de sangre preparadas con sangre cirada o sangre humana no lo son