Artículo de método

La evaluación de la progresión del ciclo celular de la madre neurales y células progenitoras en el cerebro en desarrollo del ratón después de estrés genotóxico

DOI:

10.3791/51209

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7 de mayo de 2014

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1Laboratoire de Radiopathologie, CEA DSV iRCM SCSR, 2INSERM, U967, 3Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Université Paris Sud, UMR 967

En este artículo

Resumen

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La administración de dos análogos de timidina, edu y BrdU, en ratones embarazada permite el análisis de la progresión del ciclo celular en células progenitoras neurales y en el cerebro de ratón embrionario. Este método es útil para determinar los efectos del estrés genotóxico, incluyendo la radiación ionizante, durante el desarrollo del cerebro.

Resumen

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Las neuronas de la corteza cerebral se generan durante el desarrollo cerebral de diferentes tipos de células madre y progenitoras neuronales (CPSN), que forman un epitelio pseudoestratificado que reviste los ventrículos laterales del cerebro embrionario. Tensiones genotóxicos, como la radiación ionizante, tienen efectos muy nocivos sobre el desarrollo del cerebro relacionada con la alta sensibilidad de NSPC. La elucidación de los mecanismos celulares y moleculares implicados depende de la caracterización de la respuesta al daño de ADN de estos tipos particulares de células, que requiere un método preciso para determinar CPSN progresión a través del ciclo celular en el tejido dañado. Aquí se muestra un método basado en sucesivas inyecciones intraperitoneales de Edu y BrdU en ratones embarazadas y aún más la detección de estos dos análogos de la timidina en secciones coronales del cerebro embrionario. Edu y BrdU se incorporan tanto en el ADN de las células de replicación durante la fase S y se detectan mediante dos técnicas diferentes (o azidaun anticuerpo específico, respectivamente), lo que facilita su detección simultánea. Edu y tinción de BrdU se determinan entonces para cada núcleo CPSN en función de su distancia desde el margen ventricular en una región estándar del telencéfalo dorsal. Por lo tanto esta técnica de doble etiquetado permite distinguir las células que progresaron a través del ciclo celular de los que han activado un punto de control del ciclo celular que conduce a la detención del ciclo celular en respuesta al daño del ADN.

Un ejemplo de experimento se presenta, en el que se inyectó EdU antes de la irradiación y BrdU inmediatamente después y análisis realizados en el 4 horas después de la irradiación. Este protocolo proporciona un análisis preciso de la respuesta al daño de ADN aguda de CPSN en función de la fase del ciclo celular en la que se han irradiado. Este método es fácilmente extrapolable a muchos otros sistemas con el fin de determinar el impacto de un tratamiento particular en la progresión del ciclo celular en los tejidos vivos.

Introducción

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Durante el desarrollo embrionario del cerebro, las neuronas de proyección de la corteza cerebral se generan en la zona ventricular, un epitelio pseudoestratificado compuesto de diferentes tipos de células madre neurales y células progenitoras (CPSN) que recubre los ventrículos laterales. Entre CPSN, las células gliales radiales (RGC), que sirven como células madre neurales, se someten a la migración nuclear interkinetic (INM): que realizan la mitosis en la superficie del ventrículo y la fase S en el límite basal de la zona ventricular (VZ) 1, 2,3. Ellos pueden dividir de forma simétrica para generar dos RGC o asimétricamente para generar una RGC y una neur....

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Protocolo

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1. Los procedimientos con animales

Este protocolo ha sido diseñado de acuerdo con la Directiva del Consejo Europeo de Comunidades de 24 de Noviembre de 1986 (86/609/CEE) y ha sido aprobado por nuestro comité institucional sobre bienestar animal (CETEA-CEA DSV IDF).

  1. Las inyecciones con edu / BrdU y la irradiación de E14.5 ratones preñados (Figura 2A).
    1. Preparar una solución de EdU a 1 mg / ml y de BrdU a 5 mg / ml en PBS. Realice una inyección intraperitoneal (IP) de 100 l de solución de EdU utilizando una aguja de 25 G en ratones embarazadas. 1.5 h más tarde, irradiar los ratones (irradiación corporal t....

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Resultados

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En el experimento descrito en la Figura 2, EdU se administró 1,5 horas antes de la irradiación y de BrdU sólo después de la irradiación. Cuatro tipos de células se distinguen en las rodajas corticales preparadas en 1 o 4 horas después de la irradiación, de acuerdo a la incorporación de cualquiera de EdU o BrdU, ambos o ninguno (Figuras 2A y 2B). Es importante destacar que, ni EdU ni la incorporación de BrdU cambiar el nivel de la apoptosis inducida por la radiación (dat.......

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Discusión

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El diseño experimental descrito aquí basado en la incorporación de EdU 1,5 horas antes de la irradiación y la incorporación de BrdU inmediatamente después de la irradiación permitió la demostración de que NSPCs son capaces de activar S y puntos de control G2 / M pero no el punto de control G1 / S durante la 1 ª hora después de un estrés genotóxico en el cerebro del ratón fetal. Se realizaron otros experimentos en los que se ha inyectado EdU en diferentes momentos después de la irradiación y BrdU, a sólo 1 hor.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

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La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación de la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n ° 323267, de Electricité de France (EDF) y de l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
EdULife TechnologiesA100441 mg/ml
BrdULife TechnologiesB50025 mg/ml
IBL 637CIS BIO International
Tissu Tek VIPLeica
RM2125 RT
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Kit de imagen Click-iT EdU Alexa 488Life TechnologiesC10083
Anti-BrdUGE HealthcareRPN2021/300
Cabra anti ratón-Alex594Life TechnologiesA110011/400
FluoromountSouthernBiotech0100-01
Portaobjetos de polisinaThermo scientificJ2800AMNZ
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148
PBSLife Technologies20012-068
DAPISigma-AldrichD9542
Microscopio BX51Olympus
Microscopio confocal SPELeica
Prism softwareGraphpadVersión 5.0c
Software PhotoshopAdobe
Microtomo Leica

Referencias

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  1. Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
  2. Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
  3. Taverna, E., Huttner, W. B. Neural p....

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Etiquetas

C lulas progenitoras neuralesmarcaje dual con EdU y BrdUrespuesta al da o del ADNan lisis de secciones coronalesdistancia al margen ventriculardetecci n de la fase Spunto de control del ciclo celular

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