Citotóxica eficacia de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

Resumen

El protocolo informado aquí permite la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica (PDT) en líneas de células y la optimización de la configuración de PDT antes de aplicar la terapia en modelos animales.

Resumen

En los últimos años, ha sido la dificultad en la búsqueda de terapias más eficaces contra el cáncer con menos efectos secundarios sistémicos. Por lo tanto la terapia fotodinámica es un nuevo enfoque para el tratamiento selectivo del tumor más.

Terapia fotodinámica (PDT) que hace uso de un fotosensibilizador no tóxico (PS), que, tras la activación con luz de una longitud de onda específica en la presencia de oxígeno, genera radicales de oxígeno que provocan una respuesta citotóxica ^1. A pesar de su aprobación hace casi veinte años por la FDA, PDT es hoy en día sólo se utiliza para tratar un número limitado de tipos de cáncer (de piel, de la vejiga) y las enfermedades no oncológico (psoriasis, queratosis actínica) ^2.

La principal ventaja de la utilización de la PDT es la capacidad de realizar un tratamiento local, lo que evita efectos secundarios sistémicos. Además, permite el tratamiento de tumores en sitios delicados (por ejemplo, alrededor de los nervios o vasos sanguíneos). Aquí, un intraoperative aplicación de la TFD se considera en el osteosarcoma (OS), un tumor de la médula, para apuntar los satélites de tumor primario queda atrás en el tumor de tejido circundante después de la resección quirúrgica del tumor. El tratamiento tiene como objetivo disminuir el número de recurrencias y a reducir el riesgo de (postoperatoria) la metástasis.

En el presente estudio, se presentan en los procedimientos in vitro PDT para establecer la configuración de PDT óptimas para el tratamiento eficaz de las líneas celulares usadas ampliamente OS que se utilizan para reproducir la enfermedad humana en modelos de ratón OS intratibial bien establecidos. La absorción de la PS mTHPC se examinó con un espectrofotómetro y fototoxicidad se provocaron con la luz láser de excitación de mTHPC a 652 nm para inducir la muerte celular evaluada con un ensayo de WST-1 y por el recuento de células supervivientes. Las técnicas establecidas nos permiten definir los ajustes óptimos PDT para futuros estudios en modelos animales. Son una herramienta fácil y rápida para la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica in vivo.

Introducción

Estado actual del tratamiento del arte del osteosarcoma (OS), un tumor óseo primario, abarca una combinación de quimioterapia adyuvante neo y la cirugía. Este régimen de tratamiento reveló un aumento en la tasa de supervivencia de los pacientes con enfermedad localizada de aproximadamente 20% antes del uso de la quimioterapia, a actualmente entre 60-70% ^{3, 4.} Sin embargo, en las últimas dos décadas, la supervivencia global de los pacientes OS con enfermedad local se ha estancado ^{4, 5.} Por otra parte, el 30-40% de los pacientes recae dentro de 3 años después del diagnóstico y los pacientes con enfermedad metastásica siguen teniendo una baja supervivencia de 20-30% ^{4, 6, 7.} Para mejorar el resultado de estos pacientes, las nuevas estrategias terapéuticas deben ser desarrollados.

Terapia fotodinámica (PDT), en lugar de una nueva terapia contra el cáncer, utiliza la luz de una longitud de onda específica para la excitación de un fotosensibleTizer (PS), que se acumula en las células tumorales después de su inyección en el torrente sanguíneo. La luz del láser de excitación de la PS genera radicales de oxígeno en la presencia de oxígeno, que inducen reacción citotóxica en las células tumorales y la muerte celular. Además de este mecanismo primaria, dos adicionales PDT evocados procesos biológicos contribuyen al crecimiento del tumor reducida: PDT causa vasoconstricción y la formación de trombos de la microvasculatura del tumor y, por consiguiente, la hipoxia local y la anoxia el interior del tumor, lo que lleva a un infarto del tumor. Por último, PDT lesiona y mueren las células tumorales activan una respuesta inmune local, una característica muy especial de la TFD. Esto implica el sistema del complemento y la activación de células presentadoras de antígeno dendríticas ^8. Por lo tanto, se crean condiciones para la presentación de antígenos tumorales con la posterior activación de las células linfoides, que conduce a la inmunidad específica de tumor.

Hasta ahora, la TFD se ha usado para tratar varios tipos de tumores de tejidos blandos y hyperplasia de, como queratosis actínica, el esófago de Barrett, los tumores endobronquiales, cáncer de vejiga, carcinomas de células basales y el tratamiento paliativo del cáncer de cabeza y cuello ^2. El tratamiento se sabe que inducen, la necrosis local a gran escala con sólo pocos efectos secundarios, y por lo tanto tiene el potencial para erradicar selectivamente el tejido tumoral. A pesar de estas ventajas, la aplicación de la TFD sigue siendo técnicamente más exigente que la administración de fármacos quimioterapéuticos. Con el fin de lograr la máxima eficacia, la concentración de PS, el tiempo de exposición a la luz y la transferencia total de energía de la luz necesita ser optimizado. Esto se puede hacer en experimentos in vivo, pero, debido a la gran número relativo de parámetros que necesitan ser optimizados, es más eficiente para determinar inicialmente las condiciones óptimas in vitro.

En los experimentos que se describen a continuación, hemos probado la eficacia in vitro de la TFD con una EP 5,10,15,20-tetrakis (meta-hidroxifenil) chlorin, abreviado mTHPC (Figura 1A). mTHPC es la sustancia activa en el producto medicinal Foscan, que se utiliza actualmente en la clínica para el tratamiento paliativo del cáncer de cabeza y cuello. Es uno de los PS más potente, la inducción de daño celular masiva ya a bajas concentraciones, y se demostró que es superior a otra PS en términos de penetración en el tejido ^{9, 10.} Su espectro de absorción de la luz (Figura 1B) muestra dos picos prominentes, uno a 417 nm y un segundo a 652 nm, que se utilizan para la localización de tejido de acumulación de PS y para PDT de inducción, respectivamente.

En la actualidad, una formulación liposomal de mTHPC está en desarrollo. A continuación, describimos los procedimientos para cuantificar la absorción de esta formulación liposomal, y para llevar a cabo la TFD en dos líneas celulares humanas OS, el bajo HOS metastásico y las células metastásicas 143B altos. Algunos de los datos que aquí se presentan han sido reportados anteriormente ^11. Thenfoque E descrito aquí nos permite estudiar el efecto de un fenotipo metastásico en la eficacia de la TFD. 143B células ortotópicamente, inyectados en las extremidades traseras de los ratones SCID inmunodeficientes causan intratibial tumores primarios en metástasis, un modelo que imita estrechamente la enfermedad metástasis humana. Por lo tanto, los experimentos in vitro propuestas son perfectamente adecuados para evaluar los ajustes óptimos PDT que se utilizarán posteriormente en experimentos in vivo.

Protocolo

1. La comparación de la captación de mTHPC en los respectivos baja y altamente metastásico HOS y Líneas Celulares 143B OS

1. Preparar el medio de cultivo celular que contenía DMEM, Jamón F12, y suero fetal inactivado por calor ternera en un 4.5:4.5:1 relación.
   Nota: La formulación liposomal de la PS mTHPC se disolvió en agua a una concentración final de 1,5 mg / ml mTHPC.
2. Plate 0,2 x 10 ⁶ células HOS y 143B / pocillo en placas de 6 pocillos (triplica para cada condición) y dejar que las células se adhieran durante la noche.
   Nota: el número tiene que ser ajustado a las líneas de células individuales. Una confluencia de 80-90% es el más adecuado en el momento del experimento.
3. Al día siguiente, incubar las células con una concentración fija de mTHPC para diferentes períodos de tiempo (de absorción dependiente del tiempo), o con concentraciones crecientes de mTHPC durante un período de tiempo fijo (dosis dependiente de la captación).
4. Se incuban las células con mTHPC de tiempo específico para points o concentraciones de mTHPC.
   Nota: En este estudio, tanto el HOS y líneas de células 143B se incubaron con 0,6 g / ml mTHPC de 0, 2,5, 5, o 10 horas, o con 0, 0,6, 2,5, y 10 g / ml mTHPC durante 5 h. Los períodos de tiempo y las dosis aplicadas pueden variar dependiendo de la línea celular que se utiliza.
5. Recuerde que debe trabajar siempre en la oscuridad o en condiciones de luz tenue para evitar exposición a la luz directa de las células.
6. Después de la incubación de las células en las condiciones indicadas, aspirar el medio y lavar las células tres veces con PBS. A continuación, separar las células con 0,5 ml de tripsina / EDTA y contar las células.
7. Después de la separación, centrifugar las células a 400 xg durante 5 min, aspirar el medio y volver a suspender las células en PBS a una densidad final de 200.000 células / ml.
8. Pipetear 100 l de la suspensión celular obtenida (es decir, 20.000 células) en una placa de 96 pocillos y medir la fluorescencia de estas células en un espectrofotómetro de fluorescencia. El ajustes para mediciones de fluorescencia mTHPC son: 417 nm para la excitación y 652 nm para la emisión.
9. Con el fin de calcular la cantidad de mTHPC internalizada por célula, normalizar la unidad de fluorescencia relativa (RFU) para el número de células y el volumen celular de la siguiente manera:
10. Preparar una curva estándar utilizando diferentes concentraciones de mTHPC en PBS de 0-4 g / ml (medidas uso por triplicado). Pipetear 100 l de cada dilución en una placa de 96 pocillos y medir la fluorescencia de los pozos utilizando los ajustes que se describen en el paso 1.6.
11. Divida la RFU (obtenido de 20.000 células) por la pendiente de la curva estándar lineal de mTHPC, que muestra la concentración de mTHPC (en g / ml) en el pozo.
12. Divida esta concentración mTHPC por 10 para obtener la cantidad total de mTHPC en un pocillo (en microgramos, lo que representa 100 l de suspensión celular) y dividir este valor por el volumen de 20.000 células.
13. Calcular el volumen con la fórmula para una esfera: (4/3 x π) xr ^3. Obtener el radio r midiendo el diámetro de 20 células tratadas con tripsina bajo un microscopio, y dividiendo este valor por 2.
14. Finalmente, normalizar todos los valores a los obtenidos para las células HOS después de 10 horas de incubación (dosis absorción dependiente) o tratados con 10 mg / ml mTHPC (absorción dependiente del tiempo), que se establece en 100%.

2. Medición de la fototoxicidad in vitro de PS

1. Seed 3000 células / pocillo en una placa de 96 pocillos (por triplicado para cada concentración de mTHPC utilizados) y dejar que ellos se adhieran noche a la mañana. Del mismo modo preparar una placa de 96 pozos adicionales y tratar las células como se describe a continuación, pero a continuación, poner a un lado para obtener imágenes de contraste de fase.
   Nota: el número tiene que ser ajustado para cada línea celular individual. Una confluencia del 50-60% en el momento del experimento es ideal.
   1. Tenga en cuenta que añadir el correspondiente control de toxicidad en la oscuridad de las células de cada una de las concentraciones mTHPC. LaSE son células que se incubaron en ausencia o presencia de concentraciones seleccionadas de mTHPC, pero no se ilumina.
2. Al día siguiente, incubar las células con diferentes concentraciones de mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, y 10 g / ml) en función de las líneas celulares y mantenerlos en la oscuridad durante 5 horas.
   1. Consulte la Sección 1.3.2
      Nota: El tiempo de incubación antes de la iluminación depende de la línea celular y en la PS se utiliza, por lo tanto, es aconsejable para probar diferentes concentraciones y diferentes puntos de tiempo en experimentos separados.
3. Después de la incubación para el período de tiempo indicado, se lavan las células dos veces con PBS y añadir medio fresco sin mTHPC.
4. Iluminar las células con un láser de diodo de 652 nm, específico para el espectro de absorción mTHPC (véase la Figura 1).
   1. Ajuste el láser para 21.88 mW / cm Potencia de ² a una altura de 13,5 cm distaNCE de las células, con el fin de obtener una dosis de energía de 5 J / cm ^2. Ilumine las células durante 230 seg. No iluminar las células de control de toxicidad oscuros (con y sin mTHPC).
      Nota: Siempre use gafas para proteger los ojos de la luz láser que se utiliza para la excitación del PS.
5. Después de la iluminación, mantener las células en la oscuridad a 37 º C durante 24 horas. Posteriormente, se añade agua tetrazolio soluble (WST-1) reactivo (10 μl/100 l de medio).
6. Tres horas después de la adición del reactivo WST-1, medir la absorbancia de los pocillos individuales de la placa de 96 pocillos a 415 nm.
7. Con el fin de calcular el porcentaje de células supervivientes, establecer la media de los valores obtenidos para las células no tratadas mTHPC para cada condición a 100% (es decir, sistema de iluminación, sin mTHPC y nonilluminated, sin mTHPC).

3. Estimación del número de células por Recuento celular

1. Se siembran las células 20000 / nosotrosll en una placa de 24 pocillos y dejar que ellos se adhieran noche a la mañana.
2. Se incuban las células durante 5 h con mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, y 1,25 g / ml) e iluminar ellos como se describe anteriormente.
3. Recoger el medio, se lavan las células una vez con PBS, trypsinize ellos y recogerlas por centrifugación a 400 xg durante 5 min.
4. Después de la centrifugación, aspirar el medio y volver a suspender las células en 200 l de medio fresco.
5. Contar las células en una cámara de Neubauer.

Resultados

Con las técnicas aquí reportados, se investigó PDT basada en mTHPC en OS células humanas. En primer lugar, el tiempo y la dosis de absorción depende de mTHPC se investigó en la baja HOS metastásico y en las líneas de células 143B OS altamente metastásicas. mTHPC absorción se puede evaluar mediante la medición de la fluorescencia de mTHPC con un espectrofotómetro de fluorescencia (Figura 2, reproducido con permiso de Reidy et al. ^11). Figura 2A ilustra la captación de...

Discusión

Para lograr citotoxicidad óptimo en respuesta a PDT, es fundamental para elegir los ajustes de luz láser adecuados y los tiempos de incubación. Los procedimientos aquí descritos son consistentes y eficientes para determinar la absorción de PS y cuantificar la citotoxicidad inducida por la TFD in vitro. El uso de las longitudes de onda de absorción específica de la PS mTHPC, la absorción de PS celular se puede determinar de una manera directa, y la PS se puede activar para generar especies de oxígeno reactivas c...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	PAA GmbH, Friburgo, Alemania	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Friburgo, Alemania	E15-817
Suero fetal de ternera inactivado por calor	GIBCO, Basilea, Suiza	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Alemania		Como esta formulación liposomal se origina a partir de R& D no hay número de catálogo disponible en este momento. Existencia: 1,5 mg/ml; suministrado en una mezcla 9:1 de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG; >99% de pureza)
Lector de placas Spectramax Gemini XS	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscopio Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Alemania
Ceralas PDT 652 nm Láser	biolitec AG, Jena, Alemania	LD652nm2W400u
Reactivo de tetrazolio (WST) soluble en agua	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suiza	1644807