Citotóxica eficacia de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

Resumen

El protocolo informado aquí permite la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica (PDT) en líneas de células y la optimización de la configuración de PDT antes de aplicar la terapia en modelos animales.

Resumen

En los últimos años, ha sido la dificultad en la búsqueda de terapias más eficaces contra el cáncer con menos efectos secundarios sistémicos. Por lo tanto la terapia fotodinámica es un nuevo enfoque para el tratamiento selectivo del tumor más.

Terapia fotodinámica (PDT) que hace uso de un fotosensibilizador no tóxico (PS), que, tras la activación con luz de una longitud de onda específica en la presencia de oxígeno, genera radicales de oxígeno que provocan una respuesta citotóxica ^1. A pesar de su aprobación hace casi veinte años por la FDA, PDT es hoy en día sólo se utiliza para tratar un número limitado de tipos de cáncer (de piel, de la vejiga) y las enfermedades no oncológico (psoriasis, queratosis actínica) ^2.

La principal ventaja de la utilización de la PDT es la capacidad de realizar un tratamiento local, lo que evita efectos secundarios sistémicos. Además, permite el tratamiento de tumores en sitios delicados (por ejemplo, alrededor de los nervios o vasos sanguíneos). Aquí, un intraoperative aplicación de la TFD se considera en el osteosarcoma (OS), un tumor de la médula, para apuntar los satélites de tumor primario queda atrás en el tumor de tejido circundante después de la resección quirúrgica del tumor. El tratamiento tiene como objetivo disminuir el número de recurrencias y a reducir el riesgo de (postoperatoria) la metástasis.

En el presente estudio, se presentan en los procedimientos in vitro PDT para establecer la configuración de PDT óptimas para el tratamiento eficaz de las líneas celulares usadas ampliamente OS que se utilizan para reproducir la enfermedad humana en modelos de ratón OS intratibial bien establecidos. La absorción de la PS mTHPC se examinó con un espectrofotómetro y fototoxicidad se provocaron con la luz láser de excitación de mTHPC a 652 nm para inducir la muerte celular evaluada con un ensayo de WST-1 y por el recuento de células supervivientes. Las técnicas establecidas nos permiten definir los ajustes óptimos PDT para futuros estudios en modelos animales. Son una herramienta fácil y rápida para la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica in vivo.

Introducción

Estado actual del tratamiento del arte del osteosarcoma (OS), un tumor óseo primario, abarca una combinación de quimioterapia adyuvante neo y la cirugía. Este régimen de tratamiento reveló un aumento en la tasa de supervivencia de los pacientes con enfermedad localizada de aproximadamente 20% antes del uso de la quimioterapia, a actualmente entre 60-70% ^{3, 4.} Sin embargo, en las últimas dos décadas, la supervivencia global de los pacientes OS con enfermedad local se ha estancado ^{4, 5.} Por otra parte, el 30-40% de los pacientes recae dentro de 3 años después del diagnóstico y los pacientes con enfermedad metastásica siguen teniendo una baja super....

Protocolo

1. La comparación de la captación de mTHPC en los respectivos baja y altamente metastásico HOS y Líneas Celulares 143B OS

1. Preparar el medio de cultivo celular que contenía DMEM, Jamón F12, y suero fetal inactivado por calor ternera en un 4.5:4.5:1 relación.
   Nota: La formulación liposomal de la PS mTHPC se disolvió en agua a una concentración final de 1,5 mg / ml mTHPC.
2. Plate 0,2 x 10 ⁶ células HOS y 143B / pocillo en placas de 6 pocillos (triplica para cada condición) y dejar que las células se adhieran durante la noche.
   Nota: el número tiene que ser ajustado a las líneas de células indiv....

Resultados

Con las técnicas aquí reportados, se investigó PDT basada en mTHPC en OS células humanas. En primer lugar, el tiempo y la dosis de absorción depende de mTHPC se investigó en la baja HOS metastásico y en las líneas de células 143B OS altamente metastásicas. mTHPC absorción se puede evaluar mediante la medición de la fluorescencia de mTHPC con un espectrofotómetro de fluorescencia (Figura 2, reproducido con permiso de Reidy et al. ^11). Figura 2A ilustra la captación de.......

Discusión

Para lograr citotoxicidad óptimo en respuesta a PDT, es fundamental para elegir los ajustes de luz láser adecuados y los tiempos de incubación. Los procedimientos aquí descritos son consistentes y eficientes para determinar la absorción de PS y cuantificar la citotoxicidad inducida por la TFD in vitro. El uso de las longitudes de onda de absorción específica de la PS mTHPC, la absorción de PS celular se puede determinar de una manera directa, y la PS se puede activar para generar especies de oxígeno reactivas c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	PAA GmbH, Friburgo, Alemania	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Friburgo, Alemania	E15-817
Suero fetal de ternera inactivado por calor	GIBCO, Basilea, Suiza	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, Jena, Alemania		Como esta formulación liposomal se origina a partir de R& D no hay número de catálogo disponible en este momento. Existencia: 1,5 mg/ml; suministrado en una mezcla 9:1 de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG; >99% de pureza)
Lector de placas Spectramax Gemini XS	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscopio Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Alemania
Ceralas PDT 652 nm Láser	biolitec AG, Jena, Alemania	LD652nm2W400u
Reactivo de tetrazolio (WST) soluble en agua	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Suiza	1644807