Transferencia de Embriones Utero-de trompas y vasectomía en el modelo de ratón

Resumen

La transferencia de embriones útero-tubárica utiliza la unión útero-tubárica como una barrera para impedir la salida de embriones que puede ocurrir cuando se realiza la transferencia uterina. Se requieren machos vasectomizados obtener destinatarios pseudopreñadas para la transferencia de embriones. Ambas técnicas se discuten.

Resumen

La transferencia de los embriones de preimplantación a una hembra sustituto es un paso necesario para la producción de ratones modificados genéticamente o para estudiar los efectos de las alteraciones epigenéticas originadas durante el desarrollo de preimplantación en la posterior desarrollo y adulto fetal salud. El uso de una técnica de transferencia de embriones eficaz y coherente es crucial para mejorar la generación de animales modificados genéticamente y para determinar el efecto de diferentes tratamientos en las tasas de implantación y la supervivencia a largo plazo. Los embriones en la etapa de blastocisto se transfieren generalmente por transferencia uterina, la realización de una punción en la pared uterina para introducir la pipeta de manipulación de embriones. El orificio realizado en el útero no se cierra después de que la pipeta ha sido retirada, y los embriones puede salida a la cavidad abdominal debido a la presión positiva del útero. La punción también puede producir una hemorragia que afecta la implantación, bloquea la pipeta de transferencia y puede afectar el embrión desarrollo, especialmente cuando se transfieren los embriones sin zona. En consecuencia, esta técnica a menudo resulta en tasas de supervivencia bajas embrión muy variables y globales. Evitar estos efectos negativos, la transferencia de embriones útero-tubárica tomar ventaja de la unión útero-tubárica como una barrera natural que impide la salida del embrión y evitar la punción de la pared uterina. Se requieren machos vasectomizados para la obtención de los receptores pseudopreñadas. Una técnica para llevar a cabo la vasectomía se describe como un complemento a la transferencia de embriones útero-tubárica.

Introducción

La transferencia de embriones es probablemente el procedimiento quirúrgico más frecuente se realiza en el modelo de ratón. Esta técnica es esencial para obtener la descendencia a partir de embriones sometidos a técnicas de manipulación in vitro en y, por lo tanto, constituye un paso necesario para el desarrollo de modelos modificados genéticamente mediante inyección pronuclear, la transducción lentiviral, o formación de quimeras. Además, la técnica permite el estudio de los efectos sobre el desarrollo de los diversos insultos que ocurren durante el desarrollo de preimplantación. El uso de técnicas de reproducción artificial ¹ o la exposición a con....

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Cuidado de Animales y el empleo Comites Área Beltsville (BAACUC 11-015), de acuerdo con el USDA y Cuidado de Animales Pautas del uso.

1. Anestesia y Analgesia (comunes a los procedimientos quirúrgicos)

1. Pesar el ratón y cargar los siguientes anestésicos y analgésicos en dos jeringas de 1 ml con 27 g de agujas:
   1. La ketamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g de una solución de 10 mg / ml) y xilazina (0.01 mg / g: 0,005 ml / g de una solución 2 mg / ml).
   2. La buprenorfina (0,1 g / g: 0,01 ml de una solución 0,01 mg / ml).
   ....

Resultados

Transferencia de embriones útero-tubárica proporciona un medio para transferir los embriones al útero para evitar algunas de las complicaciones asociadas a la transferencia de embriones del útero ^2,9,10. En la Tabla 1 se muestra algún resultado representante hemos obtenido la transferencia de blastocistos CD1 sometidas a diferentes tipos de manipulaciones a destinatarios CD1 siguiendo el protocolo descrito. La supervivencia a plazo (% de los embriones resultantes en un cachorro) o la superviv.......

Discusión

La vasectomía es una técnica quirúrgica relativamente sencillo que no implica mayores dificultades. Cuando desinfecte con yodo povidona y etanol asegúrese de que el último lavado (con etanol) elimina la povidona yodada, ya que puede irritar el peritoneo. El acceso a los conductos deferentes también se puede lograr por el escroto o la realización de una incisión transversal en el abdomen ^8. Incisión escrotal ha sido recomendado para transversales incisión abdominal debido a la incisión relativamente m.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ketamina	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	A ordenar por un veterinario autorizado.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	A ordenar por un veterinario autorizado.
Buprenorfina	Genérica	NDC 400-42-010-01	A ordenar por un veterinario autorizado.
Pomada para los ojos	: Novartis	, Genteal,
Antibiótico	Pfizer	Clagamox, NADA #55-101.	Añadido al agua de bebida (0,3 mg/ml de amoxicilina trihidrato y 0,075 mg/ml de clavulanato potásico). Añadir 1,5 ml del frasco reconstituido de 15 ml a 250 ml de agua.
Pinza dentada de vendaje	ROBOZ	RS-8120	Cualquier pinza recta de acero de grado quirúrgico de tamaño mediano funcionará.
Pinza dentada de microdisección	ROBOZ	RS-5137	Estas están curvadas en un ángulo de 90º. Se pueden usar pinzas rectas si se prefiere.
Pinza de microdisección ligeramente curvada	ROBOZ	RS-5136	Este modelo es especialmente útil para sujetar el oviducto.
Tijeras	ROBOZ	RS-5880	Cualquier tijera recta pequeña de acero de grado quirúrgico regular funcionará.
Agujas de 27 G	Beckton-Dickinson	305136	También se pueden utilizar agujas más pequeñas (30 G). 25 G puede ser un poco demasiado grande.
Aplicador de clips	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Removedor de clips	MiKRon	7637	En su lugar, se pueden utilizar dos pares de pinzas dentales (ROBOZ RS-8160).
portaagujas de sutura	ROBOZ	RS-7820
Sutura	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Se puede sustituir por cualquier sutura reabsorbible 4-0 a 6-0 con una aguja curva estrecha.
Capilares de vidrio	VWR	100 pipetas calibradas por ul 53432-921	Incluye un sistema de aspiración bucal que solo requiere acoplar un 0,22 µ m en el tubo para que esté listo para usar. Se puede obtener más información en Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Quemador de gas, se puede cargar con Kigas (CH-4512, del mismo proveedor). También se pueden usar quemadores de alcohol, pero el gas proporciona una temperatura más alta y este quemador proporciona una llama pequeña y precisa.
Microscopio estereoscópico	Leica	MZFLIII	Se trata de un costoso microscopio estereoscópico con fluorescencia, que también se puede utilizar para otros fines. Hay opciones más baratas como la Leica MZ8 o la Nikon SMZ-10 o la SMZ-2B, por nombrar algunas. Es mejor utilizar dos microscopios estereoscópicos, uno para manipular los embriones (que no tiene por qué ser muy bonito) y otro para la receptora. El utilizado para el receptor debe mostrar una gran distancia desde la placa de la platina hasta la lente del objetivo, para poder enfocar 3-4 cm por encima de la placa de la platina (donde se colocará el oviducto) y aún así dejar algo de espacio para el cirujano; La mayoría de los microscopios estereoscópicos pueden hacer esto, pero algunos no.
Iluminación de fibra óptica	Dolan Jenner	Fiber lite	Para iluminar la zona quirúrgica. Hay diferentes sistemas disponibles.
Etapas cálidas	Ámbito americano	http://store.amscope.com/tcs-100.html	Estos se pueden colocar sobre la placa de la platina del microscopio estereoscópico. Es posible que se necesiten algunas modificaciones (insertar un palo para nivelar la platina) si es demasiado corto para el microscopio estereoscópico. Se puede usar una gran etapa cálida para calentar la jaula si está disponible. De lo contrario, se puede usar una almohadilla térmica normal, pero se debe verificar la temperatura.
placas de cultivo para la manipulación de embriones	Falcon	353001	351008, que hacen gotas más estrechas.

, , También se pueden utilizar