Transferencia de Embriones Utero-de trompas y vasectomía en el modelo de ratón

Resumen

La transferencia de embriones útero-tubárica utiliza la unión útero-tubárica como una barrera para impedir la salida de embriones que puede ocurrir cuando se realiza la transferencia uterina. Se requieren machos vasectomizados obtener destinatarios pseudopreñadas para la transferencia de embriones. Ambas técnicas se discuten.

Resumen

La transferencia de los embriones de preimplantación a una hembra sustituto es un paso necesario para la producción de ratones modificados genéticamente o para estudiar los efectos de las alteraciones epigenéticas originadas durante el desarrollo de preimplantación en la posterior desarrollo y adulto fetal salud. El uso de una técnica de transferencia de embriones eficaz y coherente es crucial para mejorar la generación de animales modificados genéticamente y para determinar el efecto de diferentes tratamientos en las tasas de implantación y la supervivencia a largo plazo. Los embriones en la etapa de blastocisto se transfieren generalmente por transferencia uterina, la realización de una punción en la pared uterina para introducir la pipeta de manipulación de embriones. El orificio realizado en el útero no se cierra después de que la pipeta ha sido retirada, y los embriones puede salida a la cavidad abdominal debido a la presión positiva del útero. La punción también puede producir una hemorragia que afecta la implantación, bloquea la pipeta de transferencia y puede afectar el embrión desarrollo, especialmente cuando se transfieren los embriones sin zona. En consecuencia, esta técnica a menudo resulta en tasas de supervivencia bajas embrión muy variables y globales. Evitar estos efectos negativos, la transferencia de embriones útero-tubárica tomar ventaja de la unión útero-tubárica como una barrera natural que impide la salida del embrión y evitar la punción de la pared uterina. Se requieren machos vasectomizados para la obtención de los receptores pseudopreñadas. Una técnica para llevar a cabo la vasectomía se describe como un complemento a la transferencia de embriones útero-tubárica.

Introducción

La transferencia de embriones es probablemente el procedimiento quirúrgico más frecuente se realiza en el modelo de ratón. Esta técnica es esencial para obtener la descendencia a partir de embriones sometidos a técnicas de manipulación in vitro en y, por lo tanto, constituye un paso necesario para el desarrollo de modelos modificados genéticamente mediante inyección pronuclear, la transducción lentiviral, o formación de quimeras. Además, la técnica permite el estudio de los efectos sobre el desarrollo de los diversos insultos que ocurren durante el desarrollo de preimplantación. El uso de técnicas de reproducción artificial ¹ o la exposición a concentraciones anormales de diferentes sustancias o metabolitos ^{02 de mayo} afectar el desarrollo del embrión que resulta en la implantación o placentación fallos y efectos a largo plazo en la descendencia. Una técnica de transferencia de embriones fiable y reproducible es crucial para probar los posibles efectos negativos del tratamiento experimental en la implantación y el desarrollo fetal en un hombre coherentener.

Preimplantación de embriones murinos se pueden transferir a una hembra receptora, ya sea en el oviducto a través de las ampollas de 0,5 días postcoital (dpc) receptores pseudopreñadas (de transferencia) ^3,4 oviducto o al útero de 2,5 dpc pseudopreñada receptor (transferencia uterina) ^5,6 dependiendo de su estado de desarrollo. Los embriones en la etapa de blastocisto, tales como los que se utilizan para generar ratones quiméricos mediante la inyección de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, se transfieren generalmente por transferencia uterina. Los blastocistos pueden también ser transferidos al oviducto de un DPC receptor 0.5, pero constituye una prueba menos fisiológica para los disruptores de desarrollo, debido a que el embrión se somete a diapausa y tiene 2 días para recuperarse de la lesión antes de la implantación tiene lugar. Transferencia uterina implica la punción de la pared uterina con una aguja estrecha con el fin de generar una abertura que permite el acceso de una pipeta de manipulación de embrión en el lumen uterino. Launque esta técnica puede dar buenos resultados, la supervivencia a plazo (es decir, el porcentaje de embriones transferidos que se desarrollan a un cachorro) suele ser baja e impredecible ^7,8.

La perforación de la pared uterina conlleva algunos efectos secundarios perjudiciales. En primer lugar, miometrio es un tejido altamente vascularizado y su punción a menudo resulta en una pequeña hemorragia. La sangre puede bloquear la pipeta de transferencia de embriones o invadir el lumen uterino causando la muerte embrionaria y / o fallo de implantación. Esto es particularmente relevante cuando los embriones se transfieren sin zona, ya que las células de la sangre y los desechos pueden adherirse a los blastómeros. En segundo lugar, la apertura realizada no sella después de que los embriones se han transferido, por lo que puede fluir de vuelta a través del orificio y ser expulsado a la cavidad abdominal cuando un volumen demasiado grande ha sido introducir en el útero. La transferencia de embriones útero-tubárica se describe en el presente documento se aprovechan de la unión útero-tubárica para entregar el EMBRyos en el útero sin la necesidad de perforar la pared uterina y de ese modo evitar sus consecuencias adversas ^9.

Las hembras receptoras pseudopreñadas utilizados para la transferencia de embriones se obtienen mediante monta natural con machos vasectomizados ^8. Las secreciones seminales producidos por un macho estéril son necesarios para el útero a ser receptivo a los embriones transferidos. Para obtener un receptor, un máximo de 2 hembras de 8 semanas a 6 meses de edad se colocan con un hombre sometido a la vasectomía en la tarde. A la mañana siguiente, las hembras se comprueba la presencia de un tapón de la cópula vaginal, un grupo de proteínas coaguladas del líquido seminal masculino. Como el apareamiento ocurre generalmente durante la medianoche, el día de la detección de tapón vaginal se considera 0,5 dpc. Aunque los machos vasectomizados se pueden adquirir en algunos vendedores, el procedimiento quirúrgico descrito en el presente documento es relativamente fácil y no requiere ningún instrumentos adicionales a los requeridos para la transferencia de embriones.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Cuidado de Animales y el empleo Comites Área Beltsville (BAACUC 11-015), de acuerdo con el USDA y Cuidado de Animales Pautas del uso.

1. Anestesia y Analgesia (comunes a los procedimientos quirúrgicos)

1. Pesar el ratón y cargar los siguientes anestésicos y analgésicos en dos jeringas de 1 ml con 27 g de agujas:
   1. La ketamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g de una solución de 10 mg / ml) y xilazina (0.01 mg / g: 0,005 ml / g de una solución 2 mg / ml).
   2. La buprenorfina (0,1 g / g: 0,01 ml de una solución 0,01 mg / ml).
2. Inmovilizar el ratón al levantar el pescuezo tan cerca de las mandíbulas como sea posible con el pulgar y los dedos índice y sosteniendo la cola entre los dedos meñique y anular.
3. Inyectar mezcla de ketamina Xilazina intraperitoneal. Con el fin de evitar la punción de órganos internos, mantenga el ratón conla cabeza ligeramente por debajo del nivel de sus caderas (Figura 1A)
4. Inyectar por vía subcutánea buprenorfina en la piel del cuello de retención entre el pulgar y el dedo índice (fig. 1B).
5. Deja el ratón en la jaula (limpio y sin ningún otro animal) en un escenario cálido.
6. Una vez inconsciente, comprobar la ausencia de reflejos del pie trasero (verificado por pizca dedo del pie). Aplicar pomada para los ojos para evitar la sequedad del ojo y para comprobar la ausencia de reflejo palpebral (fig. 1C).
7. Este protocolo proporciona un plano quirúrgico de anestesia durante un mínimo de 30 minutos, suficiente para llevar a cabo los procedimientos descritos a continuación (Protocolos 2 y 3). Si se requieren tiempos más largos, una inyección adicional de ketamina + xilazina con la mitad de la dosis descrito en 1.1.1 se puede aplicar después de 30 min. Un cambio en el patrón de respiración de un ser más rápido e irregular indica la LOss del plano de anestesia adecuado.

2. Vasectomía

1. Utilice un macho con una capacidad de apareamiento probada.
2. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos, limpiar las superficies donde se realizará la cirugía y secarlos con etanol al 70%.
3. Lleve a cabo la anestesia como se detalla anteriormente (Protocolo 1), la comprobación de la pérdida de reflejos.
4. Coloque el ratón en un escenario caliente, retire la piel con una maquinilla eléctrica de la zona ventral entre dos líneas transversales imaginarias colocó 0,5 cm y 2,5 cm por encima del pene (Figura 2A).
5. Desinfecte el área afeitada por barrido secuencial con 10% de yodo povidona y etanol al 70%.
6. Coloque el ratón en posición supina con la cola hacia el cirujano y cubierta con una toalla estéril con un agujero exponiendo la zona afeitada. Ilumine la zona quirúrgica.
7. Realizar un 10-15 mm incisio piel longitudinaln en la línea media del abdomen, alrededor de 1 cm por encima del pene. Mantenga la piel con unas pinzas dentadas vestirse y luego se corta con tijeras (Figuras 2A y 2B).
8. Realice una incisión longitudinal de 5-10 mm en la línea alba. Mantenga el músculo con microdissecting pinzas dentadas y cortar con tijeras (Figura 2C).
9. Coge la almohadilla adiposa testicular de un lado con micro pinza de disección dentadas y tire de ella para exponer testículo, conducto deferente y el epidídimo. Conducto deferente se encuentra medial a los testículos y se trata de un tubo de conexión claramente distinguibles (no pegado a la pared como el testículo epidídimo) con un vaso sanguíneo que recorre uno de los lados (Figura 2D).
10. La celebración de los conductos deferentes con disección serrado micro pinzas, fórceps vestidores llama hasta que se vuelvan de color rojo (Figura 2E ) y, a continuación, los utilizan para cortar y cauterizar los vasos deferentes en dos puntos a la vez (Figura 2F). El corte debe retirar una porción de unos 5 mm y dejar dos extremos cauterizados claramente separados (Figura 2 G).
11. Mueva los testículos, el epidídimo y el conducto deferente de nuevo a la cavidad abdominal.
12. Proceda desde el paso 9 en el otro testículo.
13. La sutura el músculo con uno o dos puntos de sutura de colchonero horizontales hechas con 5/0 sutura absorbible (Figura 2H).
14. La sutura la piel con uno o dos máquinas de cortar de la herida (Figura 2I).
15. Identificar los varones vasectomizados (anillo de oído, tatuaje dedo ...), lo mueve la jaula colocada en un escenario cálido y observar hasta que se recupere de la anestesia (consciente y mantener decúbito esternal). Una inyección subcutánea 0,5-1 ml de solución salina caliente mejora la rerecuperación. Registrar los posibles incidencias que ocurren durante la transferencia de la vasectomía, añadir antibiótico para el agua potable.
16. Grapas para heridas pueden ser retirados 10 días después de la vasectomía con un removedor de las podadoras de la herida o un par de pinzas de dientes. El macho vasectomizado estará listo para aparearse 2 semanas después de la cirugía.
17. Pruebe la infertilidad del varón vasectomizado por apareamiento con hembras fértiles antes de usarla para obtener los destinatarios.

3. Transferencia de Embriones Utero-tubárica

1. Ratón mórula o blastocisto se pueden transferir mediante esta técnica a una hembra receptora pseudopreñada a 2,5 dpc.
2. Preparar embrión pipeta de vidrio manipulación:
   1. Pulir las puntas de los capilares de vidrio con el fin de evitar daños en el soporte de pipetas.
   2. Suavizar una porción media del capilar de vidrio por calentamiento con una multa de llama mientras que girar ligeramenteel capilar con ambas manos de forma sincrónica. Una vez que la sección capilar se vuelve suave y maleable (rojo claro), retirar rápidamente del fuego y tirar de ambos extremos para reducir su diámetro externo a 130-150 micras.
   3. Espere a que el vidrio se enfríe y luego se corta por la ligera anotando la parte estrecha con un lápiz de punta de diamante, la piedra abrasiva o lima de uñas y tirando de ambos lados. La ruptura debe estar limpia y perpendicular
3. Pulir la punta por flameado muy rápidamente, dejando una abertura de 100 a 130 micras. Las pipetas se pueden almacenar para su uso posterior.
4. Warm medios manipulación de embriones (CZBH o M2, ver discusión).
5. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos, limpiar las superficies donde se realizará la cirugía y secarlos con etanol al 70%.
6. Lleve a cabo la anestesia como se detalla anteriormente (Protocolo 1), la comprobación de la pérdida de reflejos.
7. Mantener tque el ratón de un escenario caliente, retire la piel con una maquinilla eléctrica de la zona dorsal entre las rodillas y los nervios distales (Figuras 3A y 3B).
8. Desinfecte el área afeitada por barrido secuencial con 10% de yodo povidona y etanol al 70%.
9. Mueva los embriones de la incubadora a los medios de manipulación embrionaria precalentado.
10. Mueva el receptor a una etapa caliente bajo el microscopio estereoscópico y colocarlo en posición de decúbito prono lateral para el cirujano (con su cabeza mirando a la derecha oa la izquierda del cirujano).
11. Cubra el área con una toalla estéril con un agujero de la exposición de la zona afeitada e iluminar el área quirúrgica.
12. Realice una incisión transversal 1 cm (vertical) en la piel en un lugar situado en la craneal ⅓ de la línea entre la última costilla y la cadera y el ⅓ dorsal de la línea entre la espalda y el abdomen (Figuras 3A unaND 3B). Mantenga la piel con unas pinzas dentadas vestir y cortar con tijeras (Figura 3C).
13. Una vez que la piel ha sido cortado, ovario (rojo / naranja) o la almohadilla de tejido adiposo que rodea el ovario (blanco) se pueden visualizar a través de la pared del cuerpo. Realizar un 0,3-0,5 cm incisión transversal (vertical) en la pared del cuerpo sobre el ovario o almohadilla adiposa en un lugar donde la incisión no corta ningún vaso sanguíneo grande. Mantenga el músculo con micro pinza de disección dentadas y cortar con tijeras (Figura 3D).
14. Mueve el ratón para tener frente a su cabeza hacia el cirujano.
15. Cargue la pipeta manipulación de embriones (Figura 3E):
    1. Permita que el medio CZBH para ascender por capilaridad a través de la parte estrecha de la pipeta hasta la manipulación de unos 5 mm de la parte más ancha.
    2. Tome una pequeña burbuja de aire (0,2-0,5 mm).
    3. Introducir los embriones (5-10) enuna cantidad mínima de medios de comunicación (2-4 mm).
    4. Tome otra burbuja de aire pequeña (0,2-0,5 mm) y una pequeña cantidad de medio (0,5-1 mm).
    5. Deje la pipeta de vidrio adjunta al titular aspirador bucal o en el dispositivo de accionamiento manual, listo para el paso de 3.17.
16. Coge la almohadilla adiposa que rodea el ovario con micro pinza de disección dentadas y tire de él hacia la cabeza del ratón para exponer el ovario, oviducto, y una pequeña porción de la parte superior del útero fuera de la cavidad abdominal (Figuras 3F y 3G).
17. Sosteniendo la pieza de la boca de aspiración en la boca, listo para ser utilizado, agarrar la almohadilla adiposa con micro pinzas de disección dentadas para mover el oviducto y exponer la unión útero-tubárica (es decir, donde el oviducto se encuentra con el útero).
18. Mantener la unión útero-tubárica accesible, tomar pequeñas pinzas de disección micro curvas con la mano izquierda (si es diestro) y colocarlos justo debajola unión útero-tubárica agarrando el oviducto sobre 2 mm por encima de la porción.
19. Sosteniendo la unión útero-tubárica con el ligero fórceps de disección micro curvas, perfore la sección oviducto cerca de las pinzas con una aguja 27 G (Figura 3H).
20. Inserte la manipulación pipeta embrión en el orificio realizado con la aguja y el avance hacia el útero a través de la unión útero-tubárica (Figuras 3I y 3J). Una vez que la pipeta ha pasado la unión útero-tubárica (Figura 3K) se desliza fácilmente. No progresar mucho en el útero para prevenir el daño endometrial (no más de 3 mm) y el bloqueo de la pipeta por los escombros.
21. Suelte los embriones en el útero soplando suavemente (Figura 3L). Ambas burbujas de aire deben pasar por el útero. Algunos de los medios de comunicación por encima de la primera burbujatambién puede ser liberado en el útero, pero no introducir más aire, ya que puede impedir la implantación.
22. Retire la pipeta justo después de los embriones han sido puestos en libertad en el útero.
23. Mueva el oviducto y ovario de nuevo a la cavidad abdominal por el acaparamiento de la almohadilla adiposa.
24. La sutura el músculo con un punto de colchonero horizontal con 5/0 sutura absorbible (Figura 3M).
25. La sutura la piel con un clipper herida (Figura 3N).
26. Proceder de la etapa 10 en el otro lado, si es necesario.
27. Identificar el destinatario (el anillo de oído, tatuaje dedo ...), moverlo a su jaula (colocado en un escenario cálido) y observar hasta que se recupere de la anestesia (consciente y mantener decúbito esternal).
28. Anotar las posibles incidencias que se producen durante la transferencia de embriones y añadir antibiótico para el agua potable. Una inyección subcutánea 0,5-1 ml de sali calientene solución mejora la recuperación.
29. Grapas para heridas pueden ser retirados 10 días después de la transferencia de embriones con un removedor de las podadoras de la herida o dos pares de pinzas (Figura 3O). El destinatario puede ser pesado en ese día para evaluar el embarazo y estimar el número de crías. Proporcionar el material enclavado al destinatario 15 días después de la transferencia de embriones.

Resultados

Transferencia de embriones útero-tubárica proporciona un medio para transferir los embriones al útero para evitar algunas de las complicaciones asociadas a la transferencia de embriones del útero ^2,9,10. En la Tabla 1 se muestra algún resultado representante hemos obtenido la transferencia de blastocistos CD1 sometidas a diferentes tipos de manipulaciones a destinatarios CD1 siguiendo el protocolo descrito. La supervivencia a plazo (% de los embriones resultantes en un cachorro) o la superviv...

Discusión

La vasectomía es una técnica quirúrgica relativamente sencillo que no implica mayores dificultades. Cuando desinfecte con yodo povidona y etanol asegúrese de que el último lavado (con etanol) elimina la povidona yodada, ya que puede irritar el peritoneo. El acceso a los conductos deferentes también se puede lograr por el escroto o la realización de una incisión transversal en el abdomen ^8. Incisión escrotal ha sido recomendado para transversales incisión abdominal debido a la incisión relativamente m...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ketamina	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	A ordenar por un veterinario autorizado.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	A ordenar por un veterinario autorizado.
Buprenorfina	Genérica	NDC 400-42-010-01	A ordenar por un veterinario autorizado.
Pomada para los ojos	: Novartis	, Genteal,
Antibiótico	Pfizer	Clagamox, NADA #55-101.	Añadido al agua de bebida (0,3 mg/ml de amoxicilina trihidrato y 0,075 mg/ml de clavulanato potásico). Añadir 1,5 ml del frasco reconstituido de 15 ml a 250 ml de agua.
Pinza dentada de vendaje	ROBOZ	RS-8120	Cualquier pinza recta de acero de grado quirúrgico de tamaño mediano funcionará.
Pinza dentada de microdisección	ROBOZ	RS-5137	Estas están curvadas en un ángulo de 90º. Se pueden usar pinzas rectas si se prefiere.
Pinza de microdisección ligeramente curvada	ROBOZ	RS-5136	Este modelo es especialmente útil para sujetar el oviducto.
Tijeras	ROBOZ	RS-5880	Cualquier tijera recta pequeña de acero de grado quirúrgico regular funcionará.
Agujas de 27 G	Beckton-Dickinson	305136	También se pueden utilizar agujas más pequeñas (30 G). 25 G puede ser un poco demasiado grande.
Aplicador de clips	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Removedor de clips	MiKRon	7637	En su lugar, se pueden utilizar dos pares de pinzas dentales (ROBOZ RS-8160).
portaagujas de sutura	ROBOZ	RS-7820
Sutura	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Se puede sustituir por cualquier sutura reabsorbible 4-0 a 6-0 con una aguja curva estrecha.
Capilares de vidrio	VWR	100 pipetas calibradas por ul 53432-921	Incluye un sistema de aspiración bucal que solo requiere acoplar un 0,22 µ m en el tubo para que esté listo para usar. Se puede obtener más información en Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Quemador de gas, se puede cargar con Kigas (CH-4512, del mismo proveedor). También se pueden usar quemadores de alcohol, pero el gas proporciona una temperatura más alta y este quemador proporciona una llama pequeña y precisa.
Microscopio estereoscópico	Leica	MZFLIII	Se trata de un costoso microscopio estereoscópico con fluorescencia, que también se puede utilizar para otros fines. Hay opciones más baratas como la Leica MZ8 o la Nikon SMZ-10 o la SMZ-2B, por nombrar algunas. Es mejor utilizar dos microscopios estereoscópicos, uno para manipular los embriones (que no tiene por qué ser muy bonito) y otro para la receptora. El utilizado para el receptor debe mostrar una gran distancia desde la placa de la platina hasta la lente del objetivo, para poder enfocar 3-4 cm por encima de la placa de la platina (donde se colocará el oviducto) y aún así dejar algo de espacio para el cirujano; La mayoría de los microscopios estereoscópicos pueden hacer esto, pero algunos no.
Iluminación de fibra óptica	Dolan Jenner	Fiber lite	Para iluminar la zona quirúrgica. Hay diferentes sistemas disponibles.
Etapas cálidas	Ámbito americano	http://store.amscope.com/tcs-100.html	Estos se pueden colocar sobre la placa de la platina del microscopio estereoscópico. Es posible que se necesiten algunas modificaciones (insertar un palo para nivelar la platina) si es demasiado corto para el microscopio estereoscópico. Se puede usar una gran etapa cálida para calentar la jaula si está disponible. De lo contrario, se puede usar una almohadilla térmica normal, pero se debe verificar la temperatura.
placas de cultivo para la manipulación de embriones	Falcon	353001	351008, que hacen gotas más estrechas.

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