Caracterización de Sistemas Complejos Uso del Diseño de Experimentos Enfoque: Expresión de Proteínas transitoria en tabaco como un estudio de caso

Summary

Se describe un diseño de enfoque experimentos que se puede utilizar para determinar y modelar la influencia de los elementos reguladores de transgenes, los parámetros de crecimiento y desarrollo de la planta, y las condiciones de incubación en la expresión transitoria de los anticuerpos monoclonales y proteínas reportero en plantas.

Abstract

Las plantas proporcionan múltiples beneficios para la producción de productos biofarmacéuticos incluyendo bajos costos, escalabilidad y seguridad. La expresión transitoria ofrece la ventaja adicional de desarrollo a corto y tiempos de producción, pero los niveles de expresión puede variar significativamente entre los lotes, dando así lugar a preocupaciones de reglamentación en el contexto de las buenas prácticas de fabricación. Se utilizó un diseño de enfoque experimentos (DoE) para determinar el impacto de los factores más importantes, como elementos reguladores en la construcción de expresión, crecimiento de las plantas y de los parámetros de desarrollo y las condiciones de incubación durante la expresión, en la variabilidad de la expresión entre lotes. Hemos probado plantas que expresan un anticuerpo monoclonal anti-VIH modelo (2G12) y una proteína marcadora fluorescente (DsRed). Se discute la justificación de la selección de ciertas propiedades del modelo e identificar sus posibles limitaciones. El enfoque general puede ser fácilmente transferido a otros problemas debido a que los principios del modelo de unre ampliamente aplicable: selección de parámetros basada en el conocimiento, la reducción de la complejidad mediante la división del problema inicial en módulos más pequeños, la instalación del software guiado de las combinaciones óptimas de experimentos y el aumento de diseño por etapas. Por lo tanto, la metodología no sólo es útil para la caracterización de la expresión de proteínas en las plantas, sino también para la investigación de otros sistemas complejos que carecen de una descripción mecanicista. Las ecuaciones de predicción que describen la interconectividad entre los parámetros pueden ser utilizados para establecer modelos mecánicos para otros sistemas complejos.

Introduction

La producción de proteínas biofarmacéuticas en las plantas es ventajoso porque las plantas son de bajo costo para crecer, la plataforma puede ser ampliado con sólo crece más plantas, y los patógenos humanos son incapaces de replicarse ^1,2. Las estrategias de expresión transitoria basados ​​por ejemplo en la infiltración de las hojas con Agrobacterium tumefaciens proporciona beneficios adicionales ya que el tiempo entre el punto de entrega de ADN y la entrega de un producto purificado se reduce de año a menos de 2 meses ^3. La expresión transitoria también se utiliza para el análisis funcional, por ejemplo, para probar los genes ....

Protocol

1. Planificación de una estrategia DoE

1. Identificar los factores y las respuestas pertinentes para su inclusión en el diseño.
   1. Definir una o varias respuestas para la medición. Aquí, se utilizaron niveles de expresión 2G12 y DsRed (g / ml), incluyendo la diferencia mínima detectable considerado como relevantes (10 y 20 mg / ml, respectivamente) y un valor aproximado para la desviación estándar estimada del sistema (4 y 8 mg / ml, respectivamente) sobre la base de los experimentos anteriores.
   2. Utilizar la literatura disponible, los datos de los experimentos previos o diseños especializadas de selección (por ejemplo, un diseño factor....

Results

Un modelo descriptivo para la acumulación de DsRed durante la expresión transitoria utilizando diferentes promotores y 5'UTRs

DsRed de fluorescencia en los extractos de hoja se utiliza para indicar el nivel de expresión de la proteína recombinante y de este modo se utilizó como la respuesta en la estrategia DoE. La diferencia mínima detectable consideramos relevante fue de 20 mg / ml y la desviación estándar estimada del sistema fue de 8 mg / ml en base a los experimentos in.......

Discussion

Cada experimento requiere una planificación cuidadosa, porque los recursos suelen ser escasos y caros. Esto es particularmente cierto para las estrategias del Departamento de energía debido a errores durante la fase de planificación (por ejemplo, la selección de un modelo base que no cubra todas las interacciones significativas factores) pueden disminuir sustancialmente la capacidad predictiva de los modelos resultantes y así devaluar todo el experimento. Sin embargo, estos errores se pueden evitar fácilmente s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Experto-en Diseño(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.DoE	software
Triptona	Carl Roth GmbH	8952.2	Componente de medio
Extracto de levadura	Carl Roth GmbH	2363.2	Componente de medio
Cloruro de sodio	Carl Roth GmbH	P029.2	Componente de medio
Ampicilina	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiótico
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Componente de medios
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012	Microorganismo
pPAM	GenBank	AY027531	Clonación/vector de expresión;
Plásmido NucleoSpin	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Kit de aislamiento de ADN plasmídico
NucleoSpin Gel y limpieza de PCR	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Kit de purificación de ADN plasmídico
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.Espectrofotómetro
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restricciónendonucleasa
EcoRI	Nueva Inglaterra Biolabs Inc.	R3101L	Restricciónendonucleasa
AscI	Nueva Inglaterra Biolabs Inc.	R0558L	Restricciónendonucleasa
NEB 4	Nueva Inglaterra Biolabs Inc.	B7004S	Restriccióntampón endonucleasa
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Componente de medios
Tetraborato de disodio	Carl Roth GmbH	4403.3	Componente de medios
EDTA Carl	Roth GmbH	8040.2	Componente de medios
Agarosa	Carl Roth GmbH	6352.4	Componente de medios
Azul de bromofenol	Carl Roth GmbH	A512.1	Indicador de color
Xileno cianol	Carl Roth GmbH	A513.1	Indicador de color
Glicerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Componente de medios
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Cámara de electroforesis en gel
Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganismo
Electroporador 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporador
Extracto de carne de vacuno	Carl Roth GmbH	X975.2	Componente mediático
Peptona	Carl Roth GmbH	2365.2	Componente mediático
Sacarosa	Carl Roth GmbH	4621.2	Componente mediático
Sulfato de magnesio	Carl Roth GmbH	0261.3	Componente multimedia
Carbenicillina	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiótico
Kanamicina	Carl Roth GmbH	T832.3
Antibiótico Rifampicina	Carl Roth GmbH	4163.2	Imprimación antibiótica
FWD	Eurofins MWG Operon	n.a.CCT	CAG GAA GAG CAA
TAC REV	primer Eurofins MWG Operon	n.a.CCA	AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Termociclador	Applied Biosystems	4359659	Termociclador
Servidor web RNAfold	Universidad de Viena	n.a.Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizante
Grodan Cubos de lana de roca 10 x10 cm	Grodan	n.a.Bloque	lana de roca
Invernadero	n.a.n.a.Para		el cultivo
de plantasPhytotron	Ilka Zell	n.a.Para	el cultivo de plantas
Omnifix-F Solo	B. Braun		6064204 Jeringa
Murashige y sales de Skoog	Duchefa	M 0222.0010	Componente mediático
Glucosa	Carl Roth GmbH	6780.2	Componente mediático
Acetosiriringa	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Análogo
de fitohormonas  BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Fotómetro
Osram blanco frío 36 W	Osram	4930440	Fuente de luz
Fosfato disódico	Carl Roth GmbH	4984.3	Centrífuga de componentes medios
5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrífuga
Forma -86C Ultracongelador
ThermoFisher 88400Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Lector de placas de fluorescencia
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.SPR
dispositivo Protein A	Life Technologies	10-1006 Proteína de	unión a anticuerpos
HEPES Carl Roth	GmbH	9105.3	Componente de medios
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Componente de medios
Anticuerpo 2G12	Polymun	AB002	Anticuerpo de referencia