Monitorización del ensamblaje de un factor de virulencia bacteriano secretado mediante reticulación específica del sitio

Resumen

Este artículo ilustra el uso del etiquetado de radio de persecución de pulsos en combinación con la fotoreticulación específica del sitio para monitorear las interacciones entre una proteína de interés y otros factores en E. coli. A diferencia de los métodos tradicionales de reticulación química, este enfoque genera "instantáneas" de alta resolución de una vía de ensamblaje ordenada en una célula viva.

Resumen

Este artículo describe un método para detectar y analizar interacciones dinámicas entre una proteína de interés y otros factores in vivo. Nuestro método se basa en la tecnología de supresión de ámbar que fue desarrollada originalmente por Peter Schultz y sus colegas¹. Una mutación ámbar se introduce primero en un codón específico del gen que codifica la proteína de interés. A continuación, el mutante ámbar se expresa en E. coli junto con genes que codifican un ARNt supresor de ámbar y una amino acil-ARNt sintetasa derivada de Methanococcus jannaschii. Con este sistema, el análogo de aminoácido fotoactivable p-benzoilfenilalanina (Bpa) se incorpora en el codón ámbar. A continuación, las células se irradian con luz ultravioleta para unir covalentemente el residuo de Bpa a las proteínas que se encuentran dentro de 3-8 Å. La fotoreticulación se realiza en combinación con el marcaje de seguimiento de pulsos y la inmunoprecipitación de la proteína de interés para monitorear los cambios en las interacciones proteína-proteína que ocurren en una escala de tiempo de segundos a minutos. Optimizamos el procedimiento para estudiar el ensamblaje de un factor de virulencia bacteriana que consta de dos dominios independientes, un dominio que está integrado en la membrana externa y un dominio que se transloca al espacio extracelular, pero el método se puede utilizar para estudiar muchos procesos de ensamblaje y vías biológicas diferentes en células procariotas y eucariotas. En principio, los factores que interactúan e incluso los residuos específicos de factores que interactúan que se unen a una proteína de interés pueden identificarse mediante espectrometría de masas.

Introducción

A menudo es esencial identificar y caracterizar las interacciones entre una proteína de interés y otros componentes celulares para definir su papel en una vía biológica, para comprender su ensamblaje o para dilucidar su mecanismo de acción. Una amplia variedad de enfoques se utilizan comúnmente para estudiar las interacciones proteína-proteína, pero todos tienen sus limitaciones. El método más simple e imparcial para identificar proteínas que se unen a una proteína de interés es la copurificación (o coinmunoprecipitación), pero este enfoque requiere que un complejo proteico permanezca intacto durante el procedimiento de purificación. Las interacciones de proteínas débiles o transitorias se pueden estabilizar a través de la reticulación química, pero este método generalmente requiere el uso de compuestos que unen proteínas a través de aminas primarias que están ampliamente dispersas en la secuencia de proteínas. Se pueden generar patrones de reticulación complicados que son difíciles de interpretar, especialmente cuando las proteínas de interés son componentes de complejos multiproteicos. Además, debido a que los brazos espaciadores de los reticulantes químicos generalmente exceden los 10 Å de longitud, se pueden formar enlaces covalentes con proteínas que se encuentran cerca de la proteína de interés, pero que no interactúan directamente con ella. Métodos como la cromatografía de afinidad y los cribados de dos híbridos también suelen ser útiles para identificar las interacciones proteína-proteína. El primer enfoque, sin embargo, requiere reproducir condiciones que promuevan interacciones fisiológicamente significativas y no se pueden utilizar para detectar interacciones débiles. Este último enfoque requiere que las interacciones de unión puedan replicarse en el organismo huésped y se mantengan cuando una proteína de interés y sus socios de unión se colocan en el contexto de una proteína de fusión. Los métodos de dos híbridos también tienden a generar resultados falsos positivos². Una vez que se ha establecido una interacción proteína-proteína, a menudo se requiere un trabajo considerable para mapear el sitio de interacción. Quizás el inconveniente más significativo de los enfoques tradicionales es que no proporcionan ninguna información sobre la secuencia temporal de las interacciones intermoleculares o la cinética de la unión.

Este artículo describe un método simple que supera algunas de las limitaciones de otros enfoques que se utilizan para estudiar las interacciones proteína-proteína. Inicialmente, se introduce una única mutación ámbar en el gen que codifica una proteína de interés. A continuación, el mutante ámbar se coexpresa con un ARNt supresor de ámbar y una aminoacil-ARNt sintetasa derivada de Methanococcus jannaschii que han sido modificadas para incorporar el análogo de aminoácido fotoactivable p-benzoilfenilalanina (Bpa) solo en codones ámbar³. La irradiación de las células con luz ultravioleta (UV) de longitud de onda larga (~365 nm) facilita la formación de un enlace covalente entre el Bpa y las proteínas que se encuentran dentro de ~3-8 Å^4,5. En algunos contextos experimentales, también se pueden formar enlaces cruzados entre el Bpa activado y los componentes no proteicos de las células, como los lípidos y los ácidos nucleicos⁶. Las moléculas que terminan en el codón ámbar generalmente deben distinguirse fácilmente de la proteína de longitud completa en SDS-PAGE y no pueden ser reticuladas a otras proteínas. Al someter a las células a un radiomarcaje de persecución de pulsos antes de la reticulación y luego a los productos de reticulación inmunoprecipitantes o purificadores de afinidad, se puede establecer la secuencia y la duración de las interacciones proteína-proteína. La capacidad de generar información temporal sobre las interacciones intermoleculares es especialmente valiosa para estudiar la progresión de una proteína de interés a través de cualquier vía ordenada de ensamblaje, tráfico o señalización de múltiples pasos y para identificar los intermediarios de la vía. Al igual que la reticulación química, la reticulación específica del sitio detecta las interacciones proteína-proteína que se producen en condiciones fisiológicas, pero la introducción de un reticulante en una sola posición facilita el análisis de las interacciones entre segmentos individuales de una proteína y otros factores. Esta característica única de la reticulación específica del sitio es especialmente ventajosa cuando la proteína de interés tiene múltiples segmentos o dominios que tienen el potencial de interactuar con distintos socios de unión. Además, la reticulación específica del sitio se puede utilizar en combinación con métodos como la espectrometría de masas para mapear con precisión los residuos que median las interacciones proteína-proteína. Aunque este método está optimizado para su uso en E. coli, la incorporación de análogos de aminoácidos fotoactivables en proteínas por supresión de ámbar se ha reportado en Mycobacterium, levadura y células^{de mamíferos 7-11}. Así, en principio nuestro método puede ser utilizado en otros sistemas.

Hemos utilizado este método ampliamente para identificar interacciones intermoleculares que facilitan la biogénesis de EspP, un factor de virulencia de E. coli O157:H7. EspP es miembro de una superfamilia de proteínas conocidas como "autotransportadores" que contienen un gran dominio extracelular N-terminal ("dominio de pasajeros") y un dominio aC-terminal ("dominio b") que se pliega en una estructura cilíndrica de barril b y ancla la proteína a la membrana externa (OM)¹². El mecanismo por el cual el dominio del pasajero se transloca a través del OM ha sido un misterio desde hace mucho tiempo. Al igual que todas las proteínas de la superficie celular bacteriana, la EspP debe transportarse a través de la membrana interna, transportarse a través del periplasma (el espacio entre las membranas interna y externa) y dirigirse a la MO en una serie de eventos ordenados. Después de su translocación a través de la MO, el dominio del pasajero EspP también se separa del dominio b por una escisión proteolítica y se libera de la superficie de la célula. Al combinar la reticulación específica del sitio con el radiomarcaje de persecución de pulsos, hemos demostrado que ambos dominios de la proteína interactúan inicialmente con la chaperona molecular Skp en el periplasma⁶. Posteriormente, segmentos discretos del dominio b interactúan de manera estereoespecífica con los componentes de un heterooligómero llamado complejo Bam, que cataliza la integración de las proteínas b barrel en la OM bacteriana por un mecanismo desconocido. Quizás lo más interesante es que hemos encontrado que el dominio de pasajeros está en contacto con una de las subunidades del complejo Bam (BamA) a medida que atraviesa el OM¹³. Nuestros resultados nos han permitido construir un modelo detallado para el ensamblaje del autotransportador¹⁴ y han implicado al complejo Bam en el transporte del dominio de pasajeros a través del OM.

Protocolo

1. Construcción de plásmidos

1. Después de clonar un gen que codifica una proteína de interés en un vector de expresión apropiado, introduzca las mutaciones ámbar en las ubicaciones deseadas utilizando un kit de mutagénesis dirigido al sitio.
   NOTA: La información estructural y las predicciones de exposición superficial pueden servir como guías útiles para determinar las posiciones de las mutaciones. Debido a que la eficiencia de la supresión del ámbar y la reticulación puede variar considerablemente, las mutaciones del ámbar deben introducirse en múltiples posiciones. Además, debido a que el Bpa es un análogo de la tirosina y la fenilalanina, intente introducir mutaciones en ámbar en posiciones que normalmente codifican aminoácidos hidrofóbicos grandes para minimizar las perturbaciones de la estructura y función de la proteína. Por último, a la hora de elegir un vector de expresión, hay que tener en cuenta que la sobreproducción de una proteína de interés a un nivel muy alto podría limitar la eficiencia de la incorporación de Bpa.

2. Preparación de la cultura

1. Utilice la electroporación para transformar una cepa apropiada de E. coli con un plásmido que codifica el sistema de supresión de ámbar (pDULE-p Bpa; ver referencia⁴) y un plásmido compatible que codifica la proteína de interés con una mutación ámbar.
2. Células en placa en agar LB que contienen antibióticos apropiados (use 5 μg/ml de tetraciclina para seleccionar pDULE-p Bpa). Incubar las placas O/N a 37 °C.
3. Al día siguiente, inicie los cultivos de O/N de colonias individuales en 3-5 ml de medio M9¹⁴ que contenga 0,2% de glicerol, todos los L-aminoácidos excepto metionina y cisteína (40 μg/ml) y antibióticos. Incubar a 37 °C.
4. Al día siguiente, centrifugar cultivos O/N a 2.500 x g durante 5 min a RT a células de pellets. Vuelva a suspender las células en 5 ml de medio M9 fresco y repita la centrifugación.
   NOTA: Este paso de lavado es crítico para mantener los plásmidos que codifican resistencia a la ampicilina porque pequeñas cantidades de b lactamasas que están presentes en el medio de los cultivos O/N degradan la ampicilina recién agregada antes de que ocurra un crecimiento celular significativo.
5. Vuelva a suspender las células en 2 ml de medio fresco y mida la concentración de células en un espectrofotómetro (OD₅₅₀).
6. Añadir células a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenga 50 ml de medio M9 y antibióticos a DO₅₅₀=0,03. Incubar los cultivos a 37 °C en un baño de agua agitado.

3. Incorporación de BPA y preparación para la fotocruzación

NOTA: El protocolo descrito a continuación es para un curso de tiempo de muestra que tiene tres puntos de tiempo (0, 1 y 5 min). Ajuste los volúmenes en consecuencia si se desea un número diferente de puntos de tiempo. En la Figura 1 se ilustra un esquema del procedimiento.

1. Mientras los cultivos crecen, prepare una solución fresca de 1 M (1,000x) de Bpa en 1 M de NaOH (27 mg de Bpa en 100 μl 1 M de NaOH). Use un tubo de pared oscura para mantener la solución en la oscuridad.
2. Cuando los cultivos alcancen la fase logarítmica temprana a media (OD₅₅₀ = 0,2), agregue 50 μl 1 M Bpa a cada cultivo. Agregue Bpa una gota a la vez mientras agita el matraz para evitar precipitaciones. A continuación, agregue los inductores que sean necesarios para impulsar la expresión del mutante ámbar. Continúe incubando los cultivos a 37 °C durante 30 minutos más.
3. Durante el período de inducción de 30 minutos, etiquete seis tubos de centrífuga desechables de 15 ml con el punto de tiempo (0 min, 1 min, 5 min) y "+ UV" o "- UV". Coloque los tubos sobre hielo.
4. Llene una segunda cubeta de hielo con hielo y coloque una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos encima del hielo.
5. Descongele ³⁵S-metionina y ³⁵S-cisteína (o una mezcla prefabricada de los dos compuestos) para el marcaje de pulsos y prepare (o descongele) una solución de L-cisteína no radiactiva y L-metionina (100 mM cada una) para la persecución.
6. Encienda la lámpara UV cinco minutos antes del radiomarcaje.
   NOTA: La lámpara debe ser ajustable para que pueda colocarse a ~3-4 cm de las muestras en la placa de pocillos múltiples.
7. Agregue hielo (~ 2 ml) a cada tubo etiquetado como "- UV" y a dos de los pocillos en la placa de pocillos múltiples.
   NOTA: Se debe agregar hielo a un tercer pozo inmediatamente antes del punto de tiempo de 5 minutos. Es esencial colocar hielo directamente en los tubos y pocillos para detener las reacciones intracelulares inmediatamente en cada punto de tiempo y obtener así "instantáneas" precisas de una vía bioquímica específica.
8. Al final del período de inducción de 30 minutos, transfiera 25 ml del cultivo a un matraz Erlenmeyer desechable precalentado de 125 ml. Coloque el matraz en el baño de agua agitado a 37 °C.

4. Marcaje de seguimiento de pulsos e irradiación UV

NOTA: El protocolo de marcaje de seguimiento de pulsos e irradiación UV tiene muchos pasos que deben realizarse de manera oportuna y que requieren una organización considerable y una preparación previa. Todos los reactivos y tubos deben ser fácilmente accesibles. A continuación se presenta un protocolo para un experimento que tiene puntos de tiempo de 0, 1 y 5 minutos.

1. A las 0:00 (min:seg) transfiera 25 ml de cultivo a un matraz de 125 ml.
2. En el tiempo 0:30 añadir 30 μCi/ml de aminoácidos radiactivos; agitar rápidamente para mezclar. Coloque el matraz en el baño de agua agitado a 37 °C.
3. A la 1:00 agregue 250 μl de la solución de metionina-cisteína de 100 mM; agite rápidamente para mezclar.
   1. Pipetear inmediatamente 4 ml del cultivo en uno de los pocillos de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear una segunda alícuota de 4 ml en el tubo de 15 ml etiquetado como "0 min - UV". Regrese el matraz al baño de agua.
4. A las 2:00 pipetear 4 ml del cultivo en el segundo pocillo de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear otras 4 mlícuotas de 4 ml en el tubo de 15 ml etiquetado como "1 min - UV" y volver a colocar el matraz en el baño de agua.
5. A las 6:00 pipetear 4 ml del cultivo en el tercer pocillo de la placa multipocillo refrigerada que contiene hielo. Pipetear otras 4 mlícuotas en el tubo de 15 ml etiquetado como "5 min - UV".
6. Coloque la cubitera con la placa multipocillo bajo la lámpara UV precalentada e irradie cada muestra individualmente durante 4 min.
   NOTA: En experimentos en los que los puntos de tiempo están espaciados por lo menos 4 minutos, cada muestra debe irradiarse tan pronto como se pipetea en la placa de pocillos múltiples.
7. Transfiera las células a los tubos refrigerados de 15 ml etiquetados como "0 min +UV", 1 min +UV", etc.
8. Centrifugar las células a 2.500 x g durante 10 min a 4 °C.
9. Vuelva a suspender cada muestra en un medio M9 de 300 μl o PBS y agregue 33 μl de ácido tricloroacético (TCA) frío al 100% para precipitar las proteínas. Centrifugar los precipitados de TCA en un microfugo a máxima velocidad durante 10 min y eliminar el sobrenadante. En este punto, las muestras pueden almacenarse a -20 °C.

5. Inmunoprecipitación y detección de productos de reticulación

1. Añadir 50 μl de tampón de solubilización (15% glicerol, 200 mM de Trisbase, 15 mM de EDTA, 4% de SDS, 2 mM de PMSF) a cada muestra y calentar agitando a 95 °C durante 5 min para solubilizar la proteína precipitada.
2. Añadir 1 ml de tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) (50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1,0% de Igepal CA-630, 0,5% de desoxicolato, 0,1% de SDS) y realizar inmunoprecipitaciones estándar¹⁵ utilizando de un quinto a la mitad de cada muestra
   NOTA: Se utiliza Igepal CA-630 (octilfenil-polietilenglicol) en lugar de NP-40, que ya no está disponible comercialmente. Los dos compuestos son químicamente indistinguibles.
3. Resuelva proteínas inmunoprecipitadas por SDS-PAGE. Tinte, decolora y seque geles.
4. Exponga los geles a un detector de fósforo O/N y detecte proteínas radiactivas (incluidos los productos de reticulación) con un generador de imágenes de fósforo.

Resultados

Utilizamos fotocrosslinking específico del sitio para identificar las proteínas que interactúan con EspP durante su viaje hacia el OM. En los experimentos que se muestran aquí, los codones de fenilalanina en los residuos 1113 y 1214 fueron reemplazados por codones de ámbar. Ambas posiciones se sitúan en el bdomain, que se integra en el MO y sirve como anclaje de membrana. La estructura cristalina del dominio¹⁶ de EspPβ muestra que los dos residuos están en el lado periplásmico del barril b pero están separados...

Discusión

Este artículo describe un método que combina la fotoreticulación específica del sitio con el etiquetado de persecución de pulsos para examinar la dinámica de las interacciones entre una proteína de interés y otros componentes de una célula viva. El método es especialmente útil para estudiar procesos de varios pasos en los que la proteína interactúa secuencialmente con otros factores. A diferencia de los enfoques tradicionales de reticulación química, la fotoreticulación específica del sitio proporciona información detall...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II	Agilent	200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)	Bachem	F-2800
TRAN35S-LABEL, reactivo de marcado metabólico (35S-L-metionina y 35S-L-cisteína, >1,000 Ci/mmol)	MP Biomedicals	51006
Spectroline SB-100P Lámpara UV de súper alta intensidad, 365 nm	Spectronics Corporation	SB-110P
Bombilla de repuesto Spectroline 100S	Spectronics Corporation	11-992-15
Placa de cultivo de tejidos Falcon, 6 pocillos	Becton Dickinson Labware	353046
Desechable 125 ml Matraz Erlenmeyer	Corning	430421
Innova 3100 baño de agua agitada	Nuevo Brunswick Scientific	, n.a.