Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado

12K vistas

⸱

DOI:

10.3791/51218

⸱

27 de enero de 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

En este artículo

Resumen

La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.

Resumen

Sensibilización de la adenilato ciclasa de señalización (CA) ha sido implicado en una variedad de trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, por ejemplo el abuso de sustancias y la enfermedad de Parkinson. La activación aguda de / receptores unidos a O Gai inhibe la actividad de CA, mientras que la activación persistente de estos receptores da como resultado la sensibilización heteróloga de CA y aumento de los niveles de AMPc intracelular. Estudios anteriores han demostrado que esta mejora de la capacidad de respuesta de CA se observa tanto in vitro como in vivo después de la activación crónica de varios tipos de receptores / O-ligados Gai incluyendo D 2 de la dopamina y los receptores opioides μ. Aunque la sensibilización heteróloga de AC se informó por primera vez hace cuatro décadas, el mecanismo (s) que subyacen a este fenómeno siguen siendo ampliamente desconocidas. La falta de datos mecanicistas presumiblemente refleja la complejidad implicada con esta respuesta adaptativa, lo que sugiere que los enfoques no sesgada podrían ayudar a identificarción de las vías moleculares implicadas en la sensibilización heteróloga de CA. Estudios previos han implicado a la quinasa y la señalización Gbγ como componentes que regulan la sensibilización heteróloga de AC superpuestos. Identificar objetivos superpuestos únicos y adicionales asociados con la sensibilización de la CA, se requiere el desarrollo y validación de un ensayo de sensibilización cAMP escalable para un mayor rendimiento. Los enfoques anteriores para estudiar la sensibilización son generalmente engorroso que implica el mantenimiento continuo de cultivo de células, así como una metodología compleja para la medición de la acumulación de AMPc que implica múltiples pasos de lavado. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo basado en células robusta que se puede utilizar para la selección de alto rendimiento (HTS) en un formato de 384 pocillos facilitaría los estudios futuros. El uso de dos modelos celulares receptor D2 de la dopamina (por ejemplo. CHO-D 2L y HEK-AC6 / D 2L), hemos convertido nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (> 20 pasos 4-5 días) para un período de cinco step, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos. Este nuevo formato es susceptible de cribado molécula pequeña, y demostramos que este diseño de ensayo también se puede utilizar fácilmente para la transfección inversa de ARNip en previsión de selección de la biblioteca siRNA dirigidos.

Introducción

Un adenililciclasa adaptativo (AC) de señalización de respuesta conocido como heterólogo o sensibilizantes fue descubierto en el laboratorio del premio Nobel, el Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg propuso que el aumento de la capacidad de respuesta de CA observado después de la activación del receptor opioide δ crónica era un mecanismo implicado en la tolerancia y dependencia de opiáceos 1. Además de la activación del receptor opioide δ crónica, esta respuesta neuroadaptativos de la señalización de AC también se produce tras la activación persistente de varios otros receptores / o acoplados a Gai 2. En particular, muchos de estos receptores se asocian con el dolor, los trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, e incluyen opioide μ / κ, D 2/4 de dopamina, 5HT 1A, y M 2/4 receptores muscarínicos 2. Además de los descubrimientos del Dr. Nirenberg, un gran cuerpo de evidencia existe vinculación de la sensibilización de la señalización de CA a la activación del receptor opioide crónica tanto in vitro e in vivo 3-7. Sensibilización de CA también se ha asociado con una variedad de enfermedades que implican los receptores de dopamina D 2-como incluyendo la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson (para una revisión véase la referencia 2). A pesar de la importancia potencial de sensibilización, el mecanismo exacto (s) asociado con la activación persistente Gai / o-receptor acoplado a que conduce a un aumento de la capacidad de respuesta de CA permanece en gran medida desconocido.

Estos estudios proporcionan la justificación para el examen de los mecanismos para la sensibilización de la guanilato ciclasa como un objetivo importante neurobiológica. Igualmente, el relevancia fisiológico AC señalización 8 e importancia que isoformas AC individuales sostienen este respuesta adaptativa deberían reconocerse 2,9,10. En el contexto de nuestra investigación, las características generales asociados con la sensibilización heteróloga de las isoformas recombinantes de AC son paralelas a las características described para el estudio de las isoformas endógenas de CA. En concreto, la investigación anterior ha encontrado que la activación de las proteínas Gai / O y subunidades posterior liberación / reordenamiento βγ son requisitos importantes para la sensibilización del receptor inducida de todas las isoformas de CA. Además, varios estudios sugieren que la señalización de las proteínas quinasas y subunidades Gβγ están involucrados en la sensibilización 2,11-13. CCAA individuales también muestran patrones de sensibilización únicas y distintas 12. Por ejemplo, la exposición persistente de los receptores D2 de agonistas se asocia con la sensibilización de AC1 y AC8 a Ca 2 + estimulación / calmodulina 14,15, mientras que el AC3 estrechamente relacionada no está sensibilizado 2. AC2, AC4, y AC7 están estrechamente relacionados, sin embargo, sólo la actividad AC2 estimulado PKC-se sensibiliza con firmeza después de la exposición prolongada de los receptores D2 de agonistas 7,14,16,17. Además, AC5 y AC6 muestran un notable grado de hetersensibilización ologous a gas y la acumulación de AMPc estimulada por forskolina después de la activación de los receptores D 2 14,18-20, pero parecen diferir en su requisito para Gβγ subunidad-CA interacciones 21. Aunque la mayoría de los estudios de la sensibilización de CA han utilizado líneas celulares de modelo (por ejemplo, células HEK293 que expresan isoformas individuales AC), parece que estos resultados se traducen en modelos de células neuronales nativos 4,22. Más recientemente, los efectos de la selectivos inhibidores de moléculas pequeñas de isoformas de CA identificados en células HEK293 que expresan isoformas de CA también se pueden traducir in vivo para estudios de comportamiento 23.

La falta de un mecanismo molecular identificado para la sensibilización heteróloga probablemente refleja la complejidad de la respuesta adaptativa, así como las propiedades reguladoras únicas de la persona de CA isoformas 12. Desentrañar esta complejidad se complica aún más por el uso de engorrosos metodología tsombrero ha limitado los investigadores académicos de emplear imparciales enfoques. Por ejemplo, nuestros estudios mecanísticos anteriores implicaban el uso de modelos celulares cultivadas continuamente usando 24 - y 48-así formato de cultivo de tejidos 15. Las células cultivadas se cultivan normalmente durante 48 horas y después se sometieron a tratamiento farmacológico agonista (2-18 hr) seguido de una serie de lavados e incubaciones de células (Figura 1). Protocolos de la acumulación de AMPc específica de CA-isoforma fueron entonces emplea seguido de la medición de la acumulación de AMPc utilizando un laborioso y consume mucho tiempo [3 H] AMPc metodología 15,24 unión. La duración de principio a fin para cada ensayo general, se requiere un total de cuatro a cinco días a partir de planchas de células para el análisis de datos (Figura 1). La aplicación de nuevas tecnologías y la automatización ha llevado a mejoras notables para los estudios de sensibilización en el entorno industrial y el centro de HTS. Por ejemplo, un grupo de trabajo con el Centro Nacional de ChemiCal Genómica informó de un dos días HTS procedimiento de ensayo para identificar inhibidores de moléculas pequeñas de receptor opioide μ sensibilización inducida en formato de 1.536 pocillos 25.

El presente artículo describe nuestros esfuerzos para desarrollar un ensayo HTS para los estudios de sensibilización heteróloga utilizando tecnologías que están disponibles en la mayoría de las instituciones de investigación académica. Esta estrategia se llevó a cabo mediante la incorporación de la utilización de células criopreservadas de modelos celulares heteróloga que expresa el receptor de dopamina D 2 en combinación con isoformas de adenilato ciclasa recombinantes endógenos o individuales (CHO-D 2L o HEK-CA6 / D 2 L). Para mejorar nuestro rendimiento, hemos rediseñado nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (ca.> 20 pasos más de 4-5 días) a una de cinco pasos, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos que era esencialmente "mezclar y leer". El nuevo formato utiliza un disponible en el mercado el tiempo homogéneo de fluorescencia resuelta (HTRF) de ensayo para medir cAMP accumulation en células intactas con un lector de placa de modo multi. El ensayo es robusto y pueden someterse a cribado molécula pequeña, y se puede aplicar de manera efectiva para la detección de inhibidores de la sensibilización heteróloga. Además, se ofrecen datos que permiten la utilización de este ensayo con invertir transfección de siRNA para la selección de la biblioteca siRNA amplia dirigida o genomas con sólo una pequeña modificación del planteamiento general.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Expansión y Criopreservación de Células de Ensayo Ready

  1. Cultivo de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) en una célula plato de 15 cm 2 cultura en medio F12 de Ham suplementado con 1,0 mM de L-glutamina, 800 mg / l de G418, 300 mg / l de higromicina, 100 U / l penicilina, 100 mg / l de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS).
  2. Se incuban las células a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 hasta que las células son 90-95% de confluencia. Lavar las células con 10 l tampón fosfato salino (PBS), y cosechar las células mediante la adición de 3 l de tampón de disociación celular durante 5 min a 37 ° C. Resuspender las células por medio de 12 l de los medios de cultivo y contar las células mediante exclusión con azul de tripano.
  3. Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 l de medio de congelación (10% de sulfóxido de dimetilo, 90% de FBS). Diluir la suspensión de células para conseguir la concentración celular deseada (por ejemplo, 1-20 x 10 6 células / l).
  4. Alícuota de 1,0 l de solución de células a cada criovial. Incubar los crioviales en un recipiente de congelación de células a -80 ° C durante la noche. Transfiera los crioviales a un tanque de N2 líquido para almacenamiento a largo plazo.

2. Plating ensayo Células Ready (y Opción transfección inversa)

  1. Rápidamente descongelar un criovial congelado de las células en un 37 ° C baño de agua. Una vez que las células se descongelan, transferir las células a un tubo cónico de 15 l que contiene 9 l de Opti-MEM, y mezclar invirtiendo el tubo 3-5x.
  2. Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 l de Opti-MEM.
  3. Contar las células mediante exclusión con azul de tripano para determinar la viabilidad celular y diluir las células viables como sea necesario (por ejemplo,. 3 x 10 5 células / l de concentración) enOpti-MEM. Placa 10 l / pocillo de células en un cultivo de tejido tratado placa de 384 pocillos usando una pipeta multicanal.
  4. Hacer diluciones en serie de AMPc en Opti-MEM para generar una curva patrón para la estimación de la producción de AMPc por las células (de acuerdo con recomendaciones de los fabricantes - véase la Sección 7). Añadir 10 l / pocillo de los patrones de AMPc a la placa Nota:. Una sola curva estándar se puede preparar en una placa separada o pocillos de blanco en una de las placas de ensayo.
  5. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 durante 1 hora.

3. Invertir Opción transfección siRNA *

Esta sección es opcional y relevante a la figura 3.

  1. Preparar una solución de siRNA en ddH RNasa libre 2 O (por ejemplo, 0,4 pmol / l). Añadir 5 l a pocillos individuales de la placa de 384 pocillos, y centrifugar la placa a 100 g durante 15 síC a temperatura ambiente.
  2. Diluir Lipofectamine 2000 en Opti-MEM por un factor de 0.006 (por ejemplo, añadir 6 l de Lipofectamina 2000 a 1000 l de Opti-MEM), y mezclar pipeteando arriba y abajo.
  3. Incubar la solución de Lipofectamine 2000/Opti-MEM durante 5 min a temperatura ambiente. Añadir 5 l de la solución Lipofectamine 2000/Opti-MEM diluido a pocillos individuales de la placa de 384 pozos que ya contiene siRNA. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente.
  4. Incubar la placa durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. Células listos ensayo de placa como se describe anteriormente (Sección 2). Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente.
  6. Vuelva placa de ensayo para humidificado incubadora a 37 ° C (5% de CO 2) por 48 a 96 horas según lo determinado por génica dirigida tumbar (véase el debate).

4. Screening de moléculas pequeñas

  1. Se diluye el fármaco de interés (por ejemplo, los inhibidores de la. Molécula pequeña) en Opti-MEM a 6x las concentraciones finales deseadas. Las diluciones en serie se puede completar utilizando pipetas de mano o una estación de tratamiento de líquidos.
  2. Añadir 2,5 l / pocillo del compuesto de ensayo o tampón que contiene vehículo (por ejemplo, DMSO) para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  3. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente (de incubación es opcional).

5. Tratamiento Agonist persistente

  1. Preparar un 600 nM (es decir. 6 veces la concentración final deseada de 100 nM) solución de quinpirol en Opti-MEM.
  2. Añadir 2,5 l / pocillo de la solución quinpirol nM 600 para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  3. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 durante 2 horas.

6. Estimulación de la acumulación de AMPc

  1. Durante la incubación de 2 horas, se preparan los stimulatien solución en Opti-MEM. La solución estimulación se compone de 40 forskolina M, 2 M 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), y 4 M espiperona (todas las concentraciones en el paso 6 se 4x la concentración final deseada).
  2. Añadir 5 l / pocillo de la solución de estimulación para el lado de los pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  3. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h.

7. Temple y Estimación de la acumulación de AMPc

  1. La producción de AMPc por las células se midió usando el kit de cAMP dinámica 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, reconstituir anti-AMPc-criptato y cAMP-D2 en agua destilada. Congele alícuotas a -20 ° C para el almacenamiento a corto plazo.
  2. Diluir una alícuota de anti-AMPc-criptato y una alícuota de AMPc-D2 por separado en el tampón de lisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante para hacer soluciones de trabajo.
  3. Ladd 10 l / pocillo de la solución de trabajo anti-cAMP criptato y 10 l / pocillo de la solución de trabajo cAMP-d2 a la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta multicanal.
  4. Centrifugar la placa a 100 xg durante 15 segundos a temperatura ambiente, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Leer la placa en un lector de placas de fluorescencia (ajuste de escala automática de la sensibilidad), utilizando una excitación de 337 nm y medir las emisiones a 620 nm y 665 nm por las instrucciones del fabricante.
  6. Aplicar el análisis radiométrico para evaluar la curva patrón de AMPc por las instrucciones del fabricante. Utilizando los valores resultantes, extrapolar la acumulación de cAMP estimada en los pozos de prueba utilizando el software de análisis de datos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Parte I. Desarrollo de un ensayo de sensibilización bien heterólogo 384 para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas usando un modelo de células disponibles comercialmente.

Para el estudio de la sensibilización heteróloga en un modelo celular, hicimos una serie de mejoras que nos permitieron agilizar el ensayo en un formato "mezclar y leer". Varias de las modificaciones principales se destacan a continuación y se describen con más detalle en la discu...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

En un esfuerzo para facilitar los estudios de sensibilización heteróloga, que ampliamente hemos modificado nuestro método anterior logrando un ágil "mezcla y leer" formato que es modificable a la detección y el mecanismo de examen de acción de alto rendimiento. Las principales modificaciones a nuestro protocolo se pueden resumir de la siguiente manera: 1) el uso de células crioconservadas como reactivos de ensayo "-listo"; 2) la miniaturización del ensayo en formato de 384 pocillos, y 3) la utilizaci...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean dar las gracias al Sr. Richard Zink y Todd Wiernicki para la formación metodológica y orientación ensayo. También agradecemos a John Paul Spence para lectura cuidadosa y sugerencias editoriales. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, y Eli Lilly and Company a través del Programa de Premios de Investigación Lilly (LRAP).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CHO-K1-DRD2L celdasDiscoveRx930579C2
Jamón' s F12 mediosVWRSH30026fs
Suero fetal bovinoVWRSH3007003
G418SigmaA1720
HigromicinaFisher50-230-5556
Penicilina/estreptomicinaLife Technologies 15070063
platos de 15 cmBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
Tampón de disociación celularLife Technologies13150016
solución salina tamponada con fosfatoLife Technologies10010-049
CriovialesFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
placas de 384 pocillos tratadas con TCPerkin-Elmer6007688
Kit HTRF cAMP Dynamic 2Cisbio Bioensayos62AM4PEB
http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prisma 6Software GraphPadNA
3-Isobutil-1-metilxantinaSigmaI5879
(±)QuinpirolSigmaQ111
SpiperoneSigmaS7395
ClozapinaSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S-(-)SulpiridaSigmaS112
Lipofectamina 2000 reactivo de transfecciónInvitrogen11668019
Trypan blueLife TecnologíasT10282
Libre de agua, DNasa y RNasaMP Biomedicals821739
Gas siRNADharmaconsiRNA personalizado Control
siRNA no focalizadoDharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02
de

Referencias

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Sensibilizaci n de la adenilato ciclasaensayo de acumulaci n de cAMPcribado de alta capacidadformato de 384 pocillosc lulas criopreservadasdetecci n por HTRFcribado de mol culas peque astransfecci n inversa de siRNAreceptor de dopamina D2tratamiento con quinpirol
Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.