La activación persistente de inhibidores G acoplados a proteínas receptores da como resultado la sensibilización de la señalización de la adenilato ciclasa. Para identificar las vías moleculares esenciales, los enfoques no sesgada son necesarios, sin embargo, esta estrategia requiere el desarrollo de un ensayo de sensibilización cAMP basada en células escalable. Aquí se describe un ensayo para la sensibilización y la detección de moléculas pequeñas siRNA.
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Artículo de método
Inducido por fármacos Sensibilización de adenilciclasa: Racionalización Ensayo y miniaturización de moléculas pequeñas y siRNA aplicaciones de cribado
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Resumen
Resumen
Sensibilización de la adenilato ciclasa de señalización (CA) ha sido implicado en una variedad de trastornos neuropsiquiátricos y neurológicos, por ejemplo el abuso de sustancias y la enfermedad de Parkinson. La activación aguda de / receptores unidos a O Gai inhibe la actividad de CA, mientras que la activación persistente de estos receptores da como resultado la sensibilización heteróloga de CA y aumento de los niveles de AMPc intracelular. Estudios anteriores han demostrado que esta mejora de la capacidad de respuesta de CA se observa tanto in vitro como in vivo después de la activación crónica de varios tipos de receptores / O-ligados Gai incluyendo D 2 de la dopamina y los receptores opioides μ. Aunque la sensibilización heteróloga de AC se informó por primera vez hace cuatro décadas, el mecanismo (s) que subyacen a este fenómeno siguen siendo ampliamente desconocidas. La falta de datos mecanicistas presumiblemente refleja la complejidad implicada con esta respuesta adaptativa, lo que sugiere que los enfoques no sesgada podrían ayudar a identificarción de las vías moleculares implicadas en la sensibilización heteróloga de CA. Estudios previos han implicado a la quinasa y la señalización Gbγ como componentes que regulan la sensibilización heteróloga de AC superpuestos. Identificar objetivos superpuestos únicos y adicionales asociados con la sensibilización de la CA, se requiere el desarrollo y validación de un ensayo de sensibilización cAMP escalable para un mayor rendimiento. Los enfoques anteriores para estudiar la sensibilización son generalmente engorroso que implica el mantenimiento continuo de cultivo de células, así como una metodología compleja para la medición de la acumulación de AMPc que implica múltiples pasos de lavado. Por lo tanto, el desarrollo de un ensayo basado en células robusta que se puede utilizar para la selección de alto rendimiento (HTS) en un formato de 384 pocillos facilitaría los estudios futuros. El uso de dos modelos celulares receptor D2 de la dopamina (por ejemplo. CHO-D 2L y HEK-AC6 / D 2L), hemos convertido nuestro ensayo de sensibilización de 48 pocillos (> 20 pasos 4-5 días) para un período de cinco step, ensayo de un solo día en formato de 384 pocillos. Este nuevo formato es susceptible de cribado molécula pequeña, y demostramos que este diseño de ensayo también se puede utilizar fácilmente para la transfección inversa de ARNip en previsión de selección de la biblioteca siRNA dirigidos.
Introducción
Un adenililciclasa adaptativo (AC) de señalización de respuesta conocido como heterólogo o sensibilizantes fue descubierto en el laboratorio del premio Nobel, el Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg propuso que el aumento de la capacidad de respuesta de CA observado después de la activación del receptor opioide δ crónica era un mecanismo implicado en la tolerancia y dependencia de opiáceos 1. Además de la activación del receptor opioide δ crónica, esta respuesta neuroadaptativos de la señalización de AC también se produce tras la activación persistente de varios otros receptores / o acoplados a Gai 2. En particular, muchos de estos receptores s....
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Protocolo
1. Expansión y Criopreservación de Células de Ensayo Ready
- Cultivo de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) en una célula plato de 15 cm 2 cultura en medio F12 de Ham suplementado con 1,0 mM de L-glutamina, 800 mg / l de G418, 300 mg / l de higromicina, 100 U / l penicilina, 100 mg / l de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS).
- Se incuban las células a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 hasta que las células son 90-95% de confluencia. Lavar las células con 10 l tampón fosfato salino (PBS), y cosechar las células mediante la adición de 3 l de tampón de disociación celular durante 5 m....
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Resultados
Parte I. Desarrollo de un ensayo de sensibilización bien heterólogo 384 para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas usando un modelo de células disponibles comercialmente.
Para el estudio de la sensibilización heteróloga en un modelo celular, hicimos una serie de mejoras que nos permitieron agilizar el ensayo en un formato "mezclar y leer". Varias de las modificaciones principales se destacan a continuación y se describen con más detalle en la discu.......
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Discusión
En un esfuerzo para facilitar los estudios de sensibilización heteróloga, que ampliamente hemos modificado nuestro método anterior logrando un ágil "mezcla y leer" formato que es modificable a la detección y el mecanismo de examen de acción de alto rendimiento. Las principales modificaciones a nuestro protocolo se pueden resumir de la siguiente manera: 1) el uso de células crioconservadas como reactivos de ensayo "-listo"; 2) la miniaturización del ensayo en formato de 384 pocillos, y 3) la utilizaci.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean dar las gracias al Sr. Richard Zink y Todd Wiernicki para la formación metodológica y orientación ensayo. También agradecemos a John Paul Spence para lectura cuidadosa y sugerencias editoriales. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, y Eli Lilly and Company a través del Programa de Premios de Investigación Lilly (LRAP).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| CHO-K1-DRD2L celdas | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Jamón' s F12 medios | VWR | SH30026fs | |
| Suero fetal bovino | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Higromicina | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies 15070063 | ||
| platos de 15 cm | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Tampón de disociación celular | Life Technologies | 13150016 | |
| solución salina tamponada con fosfato | Life Technologies | 10010-049 | |
| Crioviales | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| placas de 384 pocillos tratadas con TC | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| Kit HTRF cAMP Dynamic 2 | Cisbio Bioensayos | 62AM4PEB | |
| http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prisma 6 | Software GraphPad | NA | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirol | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapina | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpirida | Sigma | S112 | |
| Lipofectamina 2000 reactivo de transfección | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Tecnologías | T10282 | |
| Libre de agua, DNasa y RNasa | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | siRNA personalizado Control | |
| siRNA no focalizado | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referencias
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by....
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Reimpresiones y permisos
