Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

Brandon C. Shelley; Geneviève Gowing; Clive N. Svendsen

doi:10.3791/51219

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

12.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/51219

⸱

15 de junio de 2014

Brandon C. Shelley¹ , Geneviève Gowing¹ , Clive N. Svendsen¹

¹Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

En este artículo

Aviso de erratum

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Resumen

Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.

Resumen

Una técnica de expansión de células para acumular grandes cantidades de células a partir de una sola muestra para experimentos de investigación y ensayos clínicos se beneficiaría en gran medida a la comunidad de células madre. Muchos métodos actuales de expansión son laboriosos y costosos, y los que implican la disociación completa pueden causar varios tipos madre y células progenitoras a someterse a la diferenciación o la senescencia temprana. Para superar estos problemas, hemos desarrollado un método de pases mecánica automática que se refiere como "cortar" que es simple y de bajo costo. Esta técnica evita la disociación química o enzimática en células individuales y en su lugar permite la expansión a gran escala de suspensión, cultivos de esferoides que mantienen el contacto célula / célula constante. El método de cortar se ha usado principalmente para células derivadas de cerebro fetal neurales progenitoras o neuroesferas, y recientemente ha sido publicado para su uso con células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes embrionarias e inducidos. El procedimiento involvES siembra neuroesferas en un cultivo de tejidos plato de Petri y posteriormente pasa a una, la cuchilla afilada estéril a través de las células de la automatización de manera efectiva el tedioso proceso de manualmente disociar mecánicamente cada esfera. La suspensión de células en cultivo proporciona una relación superficie-área-volumen favorable; como más de 500.000 células pueden ser cultivadas en una sola neuroesfera de menos de 0,5 mm de diámetro. En un matraz T175, más de 50 millones de células pueden crecer en cultivos en suspensión en comparación con sólo 15 millones en cultivos adherentes. Es importante señalar que el procedimiento de cortar ha sido utilizada bajo buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), que permite la producción de cantidades masivas de productos celulares de grado clínico.

Introducción

Hay una larga historia de la expansión de las células madre neurales de roedores en la cultura, ya sea como una monocapa ^1-3 o ^4-7 neuroesferas agregados. Además, las células progenitoras neurales humanas (hNPCs) aisladas a partir de diversas regiones del sistema nervioso central en desarrollo ^8-17 han sido expandidas in vitro. Estas células son bi-potentes, capaces de diferenciarse en astrocitos y neuronas y han sido una herramienta muy útil en el estudio del desarrollo neural ^18,19 y las enfermedades mecanismo de ^20,21. hNPCs también se han trasplantado en muchos modelos animales diferentes de enfermed....