El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Resumen

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

Resumen

La cromatina es un complejo de nucleoproteína altamente dinámico hecho de ADN y las proteínas que controla diversos procesos dependientes de ADN. Estructura de la cromatina y la función a regiones específicas está regulada por el enriquecimiento local de la histona modificaciones después de la traducción (hPTMs) y variantes, proteínas de unión a la cromatina, incluyendo factores de transcripción, y la metilación del ADN. La caracterización proteómico de la composición de la cromatina en las regiones funcionales distintos ha sido hasta ahora obstaculizada por la falta de protocolos eficientes para enriquecer tales dominios en la pureza y cantidad apropiada para el posterior análisis en profundidad por espectrometría de masas (MS). Se describe aquí una estrategia proteómica de la cromatina de nuevo diseño, llamado ChroP (roteomics CHRO Matin P), el cual se utiliza una inmunoprecipitación de la cromatina preparativa para aislar las regiones de cromatina distintos cuyas características, en términos de hPTMs, variantes y co-asociados proteínas no histonic, son analizó por MS. Nos ilustran quere la creación de ChroP para el enriquecimiento y el análisis de las regiones heterochromatic transcripcionalmente silentes, marcada por la presencia de tri-metilación de la lisina 9 de la histona H3. Los resultados obtenidos demuestran el potencial de ChroP en la caracterización de fondo el proteoma heterocromatina y probarlo como una estrategia de análisis de gran alcance para la comprensión de cómo los determinantes de proteínas distintas de la cromatina interactúan y sinergia para establecer configuraciones estructurales y funcionales específicos de locus.

Introducción

La cromatina es un complejo altamente dinámico nucleoproteína que está implicado como molde principal para todos los procesos de ADN mediada. El nucleosoma es la unidad básica repetida de la cromatina y se compone de un núcleo octamérico proteínico que contiene dos moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 y H4, alrededor de la cual 147 pb de ADN se envuelven ^1,2. Todas las histonas se estructuran como un dominio globular y una "cola" N-terminal flexible que sobresale fuera del nucleosoma. Uno de los principales mecanismos de regulación de la estructura de la cromatina y la dinámica se basa en covalentes modificaciones post-traduccionales (P....

Protocolo

1. Cultivo Celular

1. Medio estándar para chip nativo
   1. Se cultivan las células HeLa en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de glutamina, 1% penicilina / estreptomicina y 10 mM de HEPES, pH 7,5.
2. SILAC etiquetado para la reticulación de chip
   1. Se cultivan las células HeLa en medio DMEM SILAC, agotado de lisina y arginina, suplementado con 10% de SFB dializados, el 1% de glutamina, 1% penicilina / estreptomicina, 10 mM HEPES pH 7,5 y, o bien la luz L-lisina (Lys 0) y L- arginina (Arg 0) o sus homólogos pesados, L-lisina (Lys 8) y L-a....

Resultados

Inmunoprecipitación de la cromatina es una poderosa técnica utilizada para el perfil de la localización de una proteína o una modificación de las histonas a lo largo del genoma. En una proteómica equivalente, chip es seguido por la proteómica basadas en MS para identificar cualitativa y cuantitativamente los hPTMs, variantes de las histonas y las proteínas de unión a la cromatina que se inmunoprecipitaron junto con la modificación o la proteína de interés, utilizados como "cebo". En el enfoque N-ChroP, se indi.......

Discusión

Recientemente hemos descrito ChroP, una estrategia cuantitativa para la caracterización a gran escala de los componentes de la proteína de la cromatina. ChroP combina dos enfoques complementarios utilizados en el campo epigenética, CHIP y MS, aprovechando sus fortalezas y superar sus respectivas limitaciones. Chip acoplado a la secuenciación profunda (ChIP-Seq), permite el mapeo de todo el genoma de las modificaciones de histonas en la resolución de unos ³⁵ nucleosomas. Aunque ventajosa por su sensibilidad, e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Lonza	BE12-614F
FBS	Invitrogen	10270-106
SILAC DMEM	M-Medical	FA30E15086
Dializado FBS	Invitrogen	26400-044
Lisina 0 (12C6 14N2 L-lisina)	Sigma Aldrich	L8662
Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)	Sigma Aldrich	A6969
Lisina 8 (13C6 15N2 L-lisina)	Sigma Aldrich	68041
Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)	Sigma Aldrich	608033
Micrococcal Nucleasa	Roche	10 107 921 001
Tabletas de cóctel de inhibidores de proteasas completos, sin EDTA	Roche	04 693 132 001
Spectra/Por 3 tubos de diálisis, 3.5K MWCO, 18 mm de ancho plano, 50 pies de largo	Spectrumlabs	132720
QIAquick Kit de purificación de PCR	QIAGEN	28104
Anti-histona H3 tri-metilado K9-ChIP grado	Abcam	ab8898
Histona H3 péptido tri-metilo K9	Abcam	ab1773
Dynabeads Proteína G	Invitrogen	100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                                                      Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0335BOX
Kit de tinción de azul coloidal	Invitrogen	LC6025
LDS Tampón de muestra	Invitrogen	NP0007
Formaldheyde	Sigma Aldrich	F8775
Anhídrido aceti-d6	Sigma Aldrich	175641-1G
[header]
Ácido fórmico	Sigma Aldrich	94318-50ML-F
Yodoacetamida ≥ 99% (HPLC), cristalino	Sigma Aldrich	I6125
DL-Ditiothreitol	Sigma Aldrich	43815
Tripsina modificada de grado de secuenciación, congelada 100 μ g (5 y veces; 20 μ g)	Promega	V5113
Nanospray OD 360μ m x ID 75μ m, puntas ID 8 μ m sin recubrimiento Pk 5	Microcolumna Srl	FS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 y micro; m    15% C	Dr. Maisch GmbH	r13.aq.
Disco de extracción de carbono, 47 mm	Agilent Technologies	12145040
Disco de extracción catiónico	Agilent Technologies	66889-U