Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

Resumen

En ensayos in vitro para medir la replicación del virus se han mejorado en gran medida por el desarrollo de virus de ARN recombinantes que expresan luciferasa u otras enzimas capaces de bioluminiscencia. A continuación te detallamos una tubería de cribado de alto rendimiento que combina dichas cepas recombinantes de virus del sarampión y chikungunya para aislar a los antivirales de amplio espectro de bibliotecas químicas.

Resumen

Los virus de ARN son los responsables de las principales enfermedades humanas como la gripe, la bronquitis, el dengue, la hepatitis C o el sarampión. También representan una amenaza emergente debido al aumento de los intercambios en todo el mundo y las poblaciones humanas que penetran en los ecosistemas cada vez más naturales. Un buen ejemplo de una situación tan emergente es epidemias de virus chikungunya de 2005-2006 en el Océano Índico. Avances recientes en nuestra comprensión de las vías celulares que controlan la replicación viral sugieren que los compuestos destinados a funciones de la célula huésped, más que el propio virus, podrían inhibir un gran panel de virus de ARN. Algunos compuestos antivirales de amplio espectro han sido identificados con ensayos orientados a objetivos de acogida. Sin embargo, la medición de la inhibición de la replicación viral en cultivos celulares utilizando la reducción de los efectos citopáticos como una lectura todavía representa una estrategia de cribado de suma importancia. Tales pantallas funcionales se han mejorado en gran medida por el desarrollo de los virus recombinantes que expresan reportero enzimas CAPable de bioluminiscencia tal como luciferasa. En el presente informe, detallamos una tubería cribado de alto rendimiento, que combina el sarampión recombinantes y virus chikungunya con ensayos de viabilidad celular, para identificar compuestos con un perfil antiviral de amplio espectro.

Introducción

Los virus de ARN son responsables de una gran variedad de infecciones humanas, y tienen un gran impacto en las poblaciones de todo el mundo, tanto en términos de salud pública y el coste económico. Vacunas eficaces se han desarrollado contra varios virus de ARN humano, y son ampliamente utilizados como tratamientos profilácticos. Sin embargo, todavía hay una falta crítica de fármacos terapéuticos contra las infecciones de virus de ARN. De hecho, las vacunas eficaces no están disponibles frente a las principales patógenos humanos, tales como el virus del dengue, virus de la hepatitis C o el virus sincitial respiratorio humano (VRSh). Además, los virus de ARN son respo....

Protocolo

1. Preparación de placas de 96 pocillos hija con compuestos

1. Mueva placas madre de 96 pocillos que contienen 10 mM de soluciones madre de los compuestos químicos en DMSO de -20 ° C a temperatura ambiente. Diluir compuestos 5x en DMSO para obtener placas de dilución de 96 pocillos intermedios a 2 mM. La dilución se logra con la pipeta 5 l en 20 l de DMSO y la mezcla.
2. Pipetear 1 l de placas de dilución en pocillos secos de blanco, de cultivo de tejidos con código de barras placas de 96 pocillos. Este primer conjunto de placas hijas (D1) se puede utilizar para evaluar la toxicidad de los compuestos a una concentración final de 20 mM. Tienda placas hi....

Resultados

Esta tubería de detección se basa en primer lugar en la selección de compuestos que inhiben la replicación de MV y no muestran ninguna toxicidad celular significativa (figura 1, la pantalla principal). Se aprovecha de ensayos basados ​​en la luciferasa para determinar la toxicidad celular y la inhibición de la replicación viral. Todos los pasos de pipeteado y la adquisición de datos se puede realizar en un entorno de alto rendimiento con una plataforma robótica.

Toxicidad ce.......

Discusión

La tubería de cribado descrito aquí tiene como objetivo seleccionar compuestos con un perfil adecuado como inhibidores de amplio espectro de virus de ARN. Cuando una biblioteca de 10.000 compuestos se rastreó con este protocolo y se aplicaron los criterios de filtrado antes mencionados, es decir, la inhibición de la replicación del MV superior al 75%, 40 compuestos (0,4%) calificó como positivo. Además, aproximadamente la mitad de ellos mostró cierta toxicidad en el ensayo de viabilidad basado en la luciferasa,.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Plataforma Freedom EVO Plataforma	robótica	TECAN
Microplacas de cultivo celular de poliestireno de 96 pocillos, blanco	Greiner Bio One	655083
CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad celular luminiscente	Promega	G7570	Ensayo de viabilidad basado en luciferasa
Bright-Glo Sistema de ensayo de luciferasa	Promega	E2610	Reactivo que contiene luciferasa de luciferasa de luciérnaga sustrato
Renilla-Glo luciferasa Sistema de ensayo	Promega	E2710	Reactivo que contiene Renilla luciferasa sustrato
Britelite plus Reporter Gene Assay System	Perkin-Elmer	6016761	Reactivo que contiene sustrato de luciferasa de luciérnaga de luciérnaga. Se puede utilizar como alternativa al reactivo Brigh-Glo para determinar la actividad de la luciferasa.