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Biology

비행 성능의 정확하고 빠른 측정을위한 개선 된 방법에 Published: February 13, 2014 doi: 10.3791/51223
Automatic Translation
1, 1
1Department of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

여기에서 우리는 높은 처리량 검사를 가능하게 초파리의 비행 성능의 신속하고 정확한 측정하는 방법을 설명합니다.

Abstract

초파리의 비행 등의 행동 분석을위한 유용한 모델 시스템으로 입증되었습니다. 초기 비행 시험기 관련 낙하는에 날아 오일 코팅 실린더를 졸업, 착륙 높이 실린더의 벽과 접촉 충분한 추진력을 제작하기 전에 지금까지 파리 가을 방법을 평가하여 비행 성능의 측정 기준을 제공했다. 여기에서 우리는 네 개의 주요 개선 비행 시험기의 업데이트 된 버전을 설명합니다. 첫째, 우리는 파리가 사용자들 사이 변동성을 제거 시험과 비슷한 속도로 비행 실린더를 입력 할 수 있도록 "드롭 튜브"를 추가했다. 둘째, 우리는 엉 키게 트랩, 라이브 곤충을 포착하기 위해 설계된 접착제 코팅 이동식 플라스틱 시트에 오일 코팅을 대체했다. 셋째, 우리는 비행 능력을보다 정확하게 식별 할 수 있도록 더 긴 실린더를 사용합니다. 넷째 우리는 비행 성능의 점수를 자동화하는 디지털 카메라와 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 이러한 개선은 랩을 허용ID, 비행 행동의 양적 평가, 대규모 데이터 세트와 대규모 유전 화면에 유용합니다.

Introduction

초파리는 오랜 동작 하나의 유전 적 기초를 연구하는 데 사용되었으며, 연구자 동작 2-6의 각종 유형을 분석 할 수있는 여러 가지 방법을 고안했다. 파리는 신경 근육 질환 (7)의 유용한 모델을 제공하는 유용하고있다. 전위의 행동을 연구하는 데 사용되는 일반적인 분석은 비행 성능입니다. 원래 비행 시험기 비행 결함이있는 돌연변이 체를 식별하기위한 비행 능력 (1)의 정량적 평가에 유용하지만, 높은 처리량 화면에 대한 응용 프로그램을 제한하는 몇 가지 단점이 있습니다 : 오일 코팅 실린더의 사용은 지저분하고 복잡와 같은 특정 기능을 가변 힘으로 튜브에 실린더와 파리의 도입의 길이는 양적 정확성을 감소하고, 그것이 테스터의 라이브 파리를 복구하는 것은 어렵다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 개선의 번호를 포함하는 비행 시험기를 수정했습니다. 우리는 "드롭 TU 추가우리는 쉽게 정리 및 개별 파리의 복구를 위해 수있는 접착제로 코팅 된 이동식 아크릴 시트를 사용하여 실험과 사용자 간의 가변성을 제거하기 위해 파리를 소개하는 "수.. 우리는 양적 정확성과 신뢰성을 개선하기 위해 비행 튜브의 길이를 증가하고있다. 마지막으로 우리는 디지털 카메라와 파리의 방문 높이를 계산하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 우리는 이러한 개선은 비행 성능에 결함이 대규모 유전 화면을 수행에 관심있는 모든 실험실에 유용 할 것으로 판단된다.

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Protocol

1. 비행 검사자 조립

  1. 링에 탑승 보안 실린더 체인 클램프를 사용하여 1 대. (접시의 무게를위한 실린더 아래 3cm 정도 둡니다.)
    (참고 : 우리가 사용하는 항공 실린더는 13.5 cm의 직경 90 ㎝ 길이입니다.)
  2. 비행 실린더 아래에 미네랄 오일의 얇은 층으로 접시의 무게를 삽입합니다.
  3. 링에 대한 보안 깔때기 링 클램프와 발톱 클램프를 사용하여 2 대. 깔때기의 바닥 비행 실린더의 윗부분과 같이되도록 깔때기의 높이를 조정합니다. (주 : 깔때기의 선단 직경이 바이알을 통해 떨어지지 않도록 드롭 튜브에 넣고, 튜브의 외경보다 작아야한다.)
  4. 깔때기의 상단에 드롭 튜브를 삽입하고 발톱 클램프를 사용하여 고정합니다.
    (참고 : 우리는 25cm 길이의 드롭 튜브를 사용하여 떨어지는 비행 함유 균일 한 힘으로 모든 파리의 일관된 배출 허용이 높이에서 튜브를 드롭 튜브의 내부 직경이 sligh해야한다..바이알 자유롭게 떨어질 수 있도록 병의 외경보다 큰 TLY.)
  5. 적절한 크기로 폴리 아크릴 시트 (들)을 잘라. (주 : 삽입 시트를 제거 돕기 위해, 폭은 단기 실린더의 내주보다 약간 작아야한다.)
  6. 시트에 엉 키게 함정의 얇은 층을 적용합니다. 사용하기 전에 1 시간 동안 앉아 수 있습니다. (참고 : 시트의 상단과 하단 삽입 / 제거를 위해 시트를 파악하기 위해 코팅 (약 3cm)에 충분한 공간을 둡니다.)
  7. 비행 실린더의 폴리 아크릴 아미드 시트를 삽입합니다.
  8. 소나무지지 브래킷을 사용하여 카메라 트랙을 조립한다. (참고 : 트랙의 바닥이 렌즈를 차단하지 않고 카메라를 지원할 수 있도록 그림 1B를 참조하십시오.).
  9. 스토퍼를 추가하고 제자리에 나사. (참고 : 장소 카메라가 파노라마 모드에서 전체 플라스틱 시트를 볼 수 있도록 위치에 스토퍼를.)

2. 실험을 실행

    <리> 테스트 할 파리의 병을 수집합니다. 최상의 결과를 위해, 더 이상의 20 파리 / 유리 병을 사용합니다.
  1. 부드럽게 유리 병의 바닥에 파리를 살짝 뺀 다음 드롭 튜브에 넣고 유리 병을 놓습니다.
    (참고 :이 좁은 깔때기 구멍을 돌 때까지 유리 병 드롭 튜브를 아래로 떨어지는 병이 깔때기를 돌 때, 파리가 비행 실린더에 분사된다..)
  2. 빈 유리 병을 제거하는 드롭 튜브를 들어 올립니다.
    (참고 : 동일한 테스트 그룹의 파리의 여러 병이 하나의 폴리 아크릴 아미드 시트에 정량 할 수있는 우리는 최대 200 파리 (20 파리 각 10 병)가 한 장에 테스트하고 쉽게 이미지가 될 수 있다는 것을 찾을 수 있습니다..
  3. 플라스틱 시트를 제거하고 평평한 흰색 표면에 놓습니다.
    (주 : 벤치 탑은 어두운 색의 경우 흰색 포스터 보드를 사용할 수있다.)
  4. 플라스틱 시트 위에 카메라 트랙을 조립합니다. 카메라의 시야에있는 시트의 상하 양쪽을받는 시트 위에서 충분히 높아야한다.
  5. 일을 따라 카메라를 밀어E 트랙 파노라마 이미지를 얻기 위해 "캡처"버튼을 누른 상태.
  6. 기름에 착륙 비행의 수는 각 시험에 대해 수동으로 계산 될 수있다.
  7. 반복은 주어진 실험의 모든 조건을 2.2-2.7 단계를 반복합니다. 파리는 각 시험 사이의 시트에서 제거 할 수 있습니다. 대안 적으로, 여러 장의 각 시험 삼아 새로운 시트로 사용될 수있다.

3. 데이터 수집

  1. ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 열려있는 이미지 파일.
  2. 이미지 자르기 만 착지 면적을 포함하는 데 필요한 경우. (이 엉 키게 함정에 코팅 된 영역입니다.)
  3. 8 비트 그레이 스케일 이미지를 변환합니다.
  4. 흰색 배경을 필터링 "임계 값"을 만듭니다.
    (이미지 → → 임계 값을 조정합니다.)
  5. "입자를 분석"메뉴를 사용하여 각 비행을 식별하는 매개 변수를 설정합니다.
    입자를 식별하는 데 사용되는 매개 변수를 정의 (입자 분석 → 분석). 우리는 설정으로, 우리는 발견이를 사용하여5-90 픽셀 2, 0.4 ~ 1.0의 원형의 영역을 정확하게 모든 샘플을 식별합니다.
  6. 각 입자에 대한 좌표의 생성 된 목록을 사용하여 각 비행의 위치를​​ 측정한다. 픽셀 X 좌표 착지 높이를 계산하기 위해 센티미터로 전환시킬 수있다.
  7. (Microsoft Excel과 같은) 스프레드 시트로 테이블을 가져옵니다.

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Representative Results

그림 1A는 업데이트 된 비행 시험기 어셈블리의 개략도를 보여줍니다. 그림 1B 트랙 디자인은 카메라의 시야를 차단하지 않고 파노라마 이미지를 촬영 할 수 있습니다 보여줍니다. 대표 결과 결함 8-10 알려진 비행이 굼벵이 돌연변이 체의 비행 성능, 야생 형 캔톤-S는 파리에 비교 그림 2에 나타내었다. 제어는 지속적으로 개인 간의 약간의 확산 및 73 ± 2.0 cm의 평균 방문 높이, 실린더의 상단에 착륙 비행. 반면, 굼벵이 파리는 44 ± 4.1 cm의 평균을 훨씬 더 다양한 착륙 확산, 그리고 매우 낮은 토지를 표시합니다. 모든 파리는 3 일 이전을 실온 (23 ℃)에 올렸다.

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그림 1. 의 비행 시험기, 카메라, 및 트랙의 다이어그램. (A) 그림 업데이트 된 비행 시험기에 설정합니다. 링 1은 90cm 높은 비행 실린더를 보유하고 스탠드, 링 2 깔때기와 10cm 길이의 "드롭 튜브"를 보유하고 스탠드. (B) 카메라의 다이어그램과는 파노라마 이미지를 생산하는 데 사용되는 트랙. 카메라는 렌즈에서보기를 방해하지 않고 트랙에서 지원해야 할 것은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. 샘플 비행 실험에서 대표적인 결과. 3 일 된 칼슘의 비행 능력의 비교NTON-S 컨트롤은 돌연변이 (SLO의 TS1을) 굼벵이 운항하는 항공사. (A) 화면은 개별 파리의 방문 높이를 표시 굼벵이 및 제어 파리에 캡처합니다. 각 파란색 원은 개인 비행의 위치를​​ 나타냅니다. 이러한 착륙 높이는 각 유전자형의 평균 착지 높이 (B)뿐만 아니라 전체적인 분포 (C)를 ​​계산하기 위해 사용된다. 남성과 여성의 비행은 각 샘플에 함께 모았다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

여기에 기술 된 방법을 사용하여, 우리는 가능한 빠르게 이전보다 더 큰 효율성을 제공 초파리 돌연변이 다수의 비행 성능을 평가할 수 있었다. 우리의 실험을 위해, 우리는 일상적으로 남성과 여성을 분리하고 날개에 손상을 줄 수 침략을 제한하는 낮은 밀도 (20 명 미만 파리 / 유리 병)에 그들을 올립니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 유전 적 배경의 차이로 인해 비행 성능의 차이를 적절하게 제어하는​​ 것입니다. 우리는 또한 이전에 시험 비행에 이산화탄소 마취에서 회복하기 위해 비행 24 시간의 최소 수 있도록하는 데 도움이 찾을 수 있습니다. 또한, 파리는 잠재적 특성에 큰 영향을 미치지 않으면 서 더 빠르게 복구 할 수 추운 온도 (11 ° C)에 노출 마취 할 수있다.

이 프로토콜의 속도 제한 단계는 시험의 플라스틱 시트에서 파리를 제거하고 있습니다. 효율을 높일 수있는 한 방법은 다수의 O를 사용하는 것이다동시에 F 시트, 옆으로 그 사용으로 시트를 설정하고 데이터 수집 다음 번에 ​​모든 청소. 바닥으로 떨어질 파리들은 시트에 포함되지 않으므로, 수동으로 계산 될 필요가있을 것이다. 하지만이 수동으로 착륙 높이를 계산에 비해 간단합니다. 각 시트에 엉 키게 트랩을 다시 적용 할 필요는 코팅이 얼마나 두께에 따라 달라집니다. 새로운 코팅이 필요하기 전에 우리의 경험에서, 개별 시트는 달을 지속 할 것이다.

미네랄 오일에 엉 키게 트랩을 사용하는 또 다른 장점은 시트에서 라이브 파리를 복구 할 수있는 기능입니다. 파리는 단순히 오히려 몰입되는 것을보다 복잡하게 얽힌 함정의 표면에 붙어 있기 때문에, 각각의 파리는 쉽게 제거 할 수 있습니다. 바닥에 떨어 "날지"파리는 빈 술병과 미네랄 오일 트레이를 교체하여 복구 할 수 있습니다.

우리는 여기에 설명 된 비행 행동의 자동 측정이 숫자를 제공합니다 생각유전자 스크린에 대한 스루풋, 재현성, 및 높은 수준의 정확도를 위해 허용하기 이전 방법에 비해 장점 BER. 자동 채점은 또한 RING 분석 (11)로서 행동 적 분석을위한 처리량을 증가시키기 위해 사용되었다. 또한, 방문 높이의 직접 측정은 우리가 비행 성능에 미묘한 차이를 감지 할 수 있도록, 간단한 통과 / 실패 측정 (% 전단지 등.)보다 더 큰 감도를 제공한다.

여기에 설명 된 분석은 비행 속도 12 운동 13 자유 비행 응답의 시각적 인 제어를 포함하여 비행 행동의 복잡한 측면을 측정 이후 추가 분석에 의해 보완 될 수있다. 이러한 테스트는 더 많은 시간이 소요되는 대규모 유전 화면 및 의무는 없지만, 그들은 전위의 응답에서 특정 유전자의 기능에 대한 자세한 정보를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 F32 NS078958 (DTB) 및 R01 AG033620 (BG)을 부여합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Putty knife Home Depot 630147 www.homedepot.com
Pine back band moulding (2x) Home Depot 156469 www.homedepot.com
Furring Strip Board Home Depot 164704 www.homedepot.com
Tangle-Trap Insect Trap Coating BioControl Network 268941 www.biconet.com
Laptop Computer  Apple www.apple.com/mac/
Mineral oil Fisher Scientific BP26291 www.fishersci.com
White poster board Staples 247403 www.staples.com
Polystyrene weighing dish Fisher Scientific S67091A www.fishersci.com
ImageJ Software National Institutes of Health http://rsb.info.nih.gov/ij/
Digital camera Sony DSC-TX7 www.store.sony.com
Fine forceps Fine Science Tools www.finescience.com
Polycarbonate cylinder (drop tube) McMaster-Carr 8585K62 www.mcmaster.com
Flight cylinder (acrylic) McMaster-Carr 8486K943 www.mcmaster.com
Polycarbonate sheets McMaster-Carr 85585K25 www.mcmaster.com
ring stand (2x) Fisher Scientific S47808 www.fishersci.com
Ring support Fisher Scientific S47791 www.fishersci.com
Three-prong extension clamps (x2) Fisher Scientific 05-769-7Q www.fishersci.com
Funnel Fisher Scientific 10-500-3 www.fishersci.com
chain clamps (2x) VWR 21573-275 www.vwr.com
Glass vials VWR 66020-198 www.vwr.com

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References

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동작 제 84, 신경 과학 비행 성능,
비행 성능의 정확하고 빠른 측정을위한 개선 된 방법에<em&gt; 초파리</em
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Babcock, D. T., Ganetzky, B. An… More

Babcock, D. T., Ganetzky, B. An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila. J. Vis. Exp. (84), e51223, doi:10.3791/51223 (2014).

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