Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes
En este artículo
Resumen
Resumen
Con el fin de dirigirse a una sola proteína a múltiples orgánulos subcelulares, las plantas normalmente duplican los genes pertinentes, y expresan cada gen por separado utilizando estrategias regulatorias complejas incluyendo promotores diferenciales y / o secuencias de señal. Ingenieros metabólicos y biólogos sintéticos interesadas en la orientación de las enzimas a un orgánulo particular, se enfrentan a un desafío: Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen múltiples veces. Este trabajo presenta una solución a esta estrategia: aprovechar splicing alternativo del mRNA. Esta tecnología se aprovecha de cloroplasto establecido y secuencias de peroxisomas focalización y los combina en un único ARNm que se empalmados alternativamente. Algunas variantes de empalme se envían al cloroplasto, algunos hasta el peroxisoma, y algunos al citosol. Aquí, el sistema está diseñado para múltiples orgánulo que apunta con el corte y empalme alternativo. En este trabajo, se espera que las buenas prácticas agrarias para ser exprEssed en el cloroplasto, citosol, y peroxisomas por una serie de diseñados racionalmente 5 'etiquetas de ARNm. Estas etiquetas tienen el potencial de reducir la cantidad de clonación requerido cuando los genes heterólogos necesitan ser expresado en múltiples orgánulos subcelulares. Las construcciones fueron diseñadas en el trabajo anterior 11, y se clonaron utilizando el montaje de Gibson, un método de clonación independiente de ligación que no requiere enzimas de restricción. Los plásmidos resultantes se introdujeron en las células epidérmicas de la hoja de Nicotiana benthamiana con un protocolo modificado pistola de genes. Finalmente, las hojas transformadas se observaron con microscopía confocal.
Introducción
Este trabajo es un proyecto de ingeniería / biología sintética metabólica en la que las células vegetales están diseñados para expresar una proteína reportera en varios orgánulos, pero con una única construcción de ADN.
Un enfoque para dirigir proteínas a más de un lugar de clonación implica múltiples copias genéticas, cada uno que contiene un péptido de localización diferente. Cada copia debe ser introducida por los sucesivos retransformación, o alternativamente, por retrocruzamiento transformaciones individuales 1. Esto implica la clonación por adición, y está limitado por una etiqueta de localización por terminal.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Diseño de secuencias Alternativamente empalmados-en caso de pluralidad Orgánulos Focalización
- Determinar los sitios para la expresión de la proteína final. Para este trabajo, el interés se centra en la orientación del cloroplasto, peroxisomas y citoplasma.
- Usar la literatura para identificar las secuencias de proteínas y de ADN conocidos que atacan las proteínas de los orgánulos de interés. En este caso, una orientación del cloroplasto secuencia de Arabidopsis thaliana-L isoaspartate metiltransferasa 6,15, y una secuencia dirigida a los peroxisomas de Arabidopsis thaliana-transtiretina como S-alant....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El esfuerzo de diseño fue el resultado de una planificación significativa. Novela de este proyecto es la utilización del splicing alternativo para crear un pre-ARNm que se traduce en proteínas expresadas diferencialmente. Estas proteínas se expresan en diferentes orgánulos, en este caso el cloroplasto, peroxisomas y / o citosol. Adaptamos gen Arabidopsis natural que se empalmados alternativamente 6, y se coloca conocidos cloroplasto 6 y peroxisomas 17 secuencias dirigidas en los.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En este estudio, se describen estrategias simples para la localización de una única proteína transgénica a múltiples compartimentos celulares en plantas. El objetivo era diseñar constructo que expresara un solo gen en más de un orgánulo en Nicotiana benthamiana. Las estrategias incluyen el diseño racional de construcciones de ADN basada en GFP, el montaje de Gibson, la entrega de los plásmidos de células de las hojas con la pistola de genes, y la observación de los resultados con microscopía confocal.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Jen Sheen, del Hospital General de Massachusetts por la generosa donación de plantones Nicotiana benthamiana. Jen Bush nos ayudó mucho en el asesoramiento en el cultivo de plantas y la creación de un área de la cámara de crecimiento. Tom Ferrante del Instituto Wyss ofreció ayuda decisiva con microscopía confocal. Los autores desean agradecer especialmente a Don Ingber del Hospital de Niños de Boston y el Instituto Wyss por la generosa donación de una pistola de genes y materiales asociados. Los fondos para este proyecto fueron proporcionados a través de un acuerdo de cooperación con el Departamento de la Agencia de Proyectos de....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cebadores de oligonucleótidos | IDT | (personalizado) | Diseño específico para la construcción |
| de GeneBlocks | IDT | (personalizado) | 500 bp oligonucleótidos |
| ApE software U | Utah | (descargar) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinKit de elución | Qiagen | 28004 | Se utiliza para purificar productos de PCR |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Se utiliza para preparar cantidades apropiadas para la clonación de plásmido |
| Phusion Master Mix con tampón GC | NEB | M0532S | Se utiliza para amplificar por PCR el gen de interés |
| Mezcla de reacción de ensamblaje de Gibson | NEB | E2611L | Mezcla maestra de los siguientes 9 ingredientes |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Mezcla de ensamblaje de Gibson |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 Mezcla de | montaje Gibson |
| dNTP | mix Fermentas | R0192 | Mezcla de montaje Gibson |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Mezcla de montaje Gibson |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Mezcla de montaje Gibson |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Mezcla de montaje Gibson |
| T5 exonucleasa | Epicentre | T5E4111K | Mezcla de ensamblaje Gibson |
| Phusion polimerasa | NEB | F530S Mezcla de | montaje de Gibson |
| Taq ADN ligasa | NEB | M0208L | Mezcla de montaje de Gibson |
| Gibthon.org | Sitio web para simplificar los cálculos | ||
| Plásmido PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Se utiliza para preparar el ADN para las balas de las pistolas genéticas |
| Sistema de pistola | genética BioRad | 165-2451 | Incluye todas las piezas necesarias |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Regalo de Jen Sheen, |
| MGH Microscopio confocal | Leica | SP5 X MP | Obtención de imágenes de las células resultantes |
| Portaobjetos de pozos profundos | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 71561-01 | Utilizado para la obtención de imágenes confocales |
| Un editor de plásmidos (ApE) | Universidad de Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Calculadora | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
Referencias
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
