Un modelo murino de la médula espinal cervical Lesión en estudio post-lesional Respiratorio Neuroplasticidad

Resumen

La insuficiencia respiratoria es la principal causa de muerte a raíz de una lesión de la médula espinal cervical. Tener un modelo animal preclínico reproducible, cuantificable y confiable de la insuficiencia respiratoria inducida por una lesión cervical parcial le ayudará a comprender la neuroplasticidad respiratoria y no respiratoria posterior y permiten probar estrategias de reparación putativos.

Resumen

Una lesión de la médula espinal cervical induce parálisis permanente, y, a menudo conduce a la dificultad respiratoria. Hasta la fecha, no hay terapias eficaces se han desarrollado para mejorar / mejorar la insuficiencia respiratoria después de una lesión de la médula espinal cervical alta (SCI). Aquí se propone un modelo preclínico murino de alta SCI en la cervical 2 (C2) nivel metameric estudiar diversa neuroplasticidad respiratoria post-lesional. La técnica consiste en una lesión parcial quirúrgica en el nivel C2, que inducirá un hemiparalysis del diafragma debido a una desaferenciación de los frénico motoneuronas de los centros respiratorios situados en el tronco cerebral. El lado contralateral de la lesión permanece intacta y permite la recuperación de los animales. A diferencia de otros LIC que afectan la función locomotora (en la columna torácica y lumbar de nivel), la función respiratoria no requiere la motivación de los animales y la cuantificación del déficit / recuperación se puede realizar fácilmente (diafragma y la grabación del nervio frénicos, la ventilación de todo el cuerpo). Este modelo C2 SCI preclínica es un potente, útil y fiable modelo preclínico para estudiar diversos eventos de neuroplasticidad respiratorias y no respiratorias en diferentes niveles (molecular a la fisiología) y para probar diversas estrategias terapéuticas supuestos que podrían mejorar la respiración en pacientes con lesión medular.

Introducción

Traumatismo de la médula espinal es una lesión común que se observa en la población humana con incidencias dramáticas, como la parálisis permanente. Sin embargo, la gravedad de la lesión depende del nivel y la extensión de la trauma inicial. La insuficiencia respiratoria es la causa principal de mortalidad después de una lesión de la médula espinal cervical superior (SCI) ^1. Actualmente, el único tratamiento terapéutico es para colocar el paciente bajo asistencia ventilatoria. Dado que algunos pacientes pueden ser destetados de la asistencia ventilatoria ^2, debido a la recuperación espontánea que se produce con un retraso post-lesional, la necesidad de desarrollar nuevas terapias no invasivas innovadoras es urgente ^3. Tener un buen modelo de pre-clínico estandarizado para investigar el efecto de un SCI cervical en insuficiencia respiratoria y por lo tanto, para estudiar la aplicación de estrategias terapéuticas putativas, es esencial.

En este artículo técnico, se describe un modelo murino pre-clínica o específicadeterioro respiratorio f inducida por una lesión medular cervical parcial en el nivel C2. Este modelo es utilizado actualmente por varios laboratorios de todo el mundo (para revisiones: ^4-13). Sin embargo, ligeras diferencias en el procedimiento quirúrgico se pueden observar entre los diferentes investigadores para generar este modelo murino lesión cervical en particular. El efecto de un C2 SCI en la salida respiratoria fue descrita por primera vez en 1895 por Porter ^14. Una hemisección de cuello uterino induce una desaferenciación de las motoneuronas frénicos de su unidad central (situado en el rVRG en el tronco cerebral, la figura 1A) en el lado ipsilateral de la lesión, que conduce a una actividad del nervio frénico en silencio y la parálisis posterior de diafragma. El lado contralateral se mantiene intacto y permite que el animal para sobrevivir. A diferencia de diferente SCI situado en un segmento inferior de la columna (por ejemplo una lesión contusa a nivel C4 ^15), se conserva la integridad del núcleo de las neuronas motoras frénico en ambos lados. Después de un CERVlesiones C2 ical, alguna actividad espontánea se puede observar en el lado ipsilateral (frénico y diafragma) debido a una activación de las vías sinápticas silenciosos contralateral que cruzan la línea media de la médula a nivel segmental C3-C6 (vías frénicos cruzados, CPP, Figura 1B) . La activación de la CPP, que es, por definición, una hemisección C2 combinado con un phrenicotomy contralateral que inducen una recuperación parcial del nervio frénico ipsilateral, puede ocurrir a partir de horas a semanas después de la lesión ^16-18. El efecto beneficioso real de esta vía de CPP en la recuperación respiratoria se limita ¹⁹ y de la investigación y el tratamiento debe ser desarrollado para mejorar la magnitud de la restauración espontánea ^3.

Este protocolo proporciona un tipo poderoso de modelo murino pre-clínicos para estudiar la plasticidad respiratoria post-lesional en los distintos niveles (fisiología respiratoria de las motoneuronas pre y frénicos, interneuronas, molecular y cellular, la locomoción de la extremidad delantera, por ejemplo), así como un modelo para probar estrategias terapéuticas invasivas y no invasivas destinadas a mejorar la recuperación del aparato locomotor y respiratorio después de una lesión espinal C2 parcial cervical espinal.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por el comité de ética de la silla RBUCE-UP de Excelencia (Universidad de Paris Sud, acuerdo de subvención n º 246556) y la Universidad de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines.

1. Preparación de instrumentos quirúrgicos esterilizados

1. Limpiar los instrumentos quirúrgicos con detergente de laboratorio.
2. Autoclave los instrumentos antes de la cirugía.
3. En una sesión quirúrgica, esterilizar las herramientas mediante la colocación de las puntas en un esterilizador de cuentas caliente durante 10 min a 180 ° C entre 2 cirugías.

2. Preparación de Drogas

1. Prepare 2 x 1 ml jeringas para drogas drogas preanestésica cóctel y después de la operación.
2. De acuerdo con el peso de la rata, preparar una jeringa con drogas preanestésica: carprofeno (5 mg / kg), buprenorfina (50 mg / kg), Baytril (5 mg / kg) y dexmedetomidina (0,5 mg / kg). Completar el volumen a 1 ml con Ringer lactato.
3. Preparar enotra jeringa la reversión de los medicamentos pre-anestésicos: atipamezol (500 mg / kg).

3. La anestesia de la rata

1. Administrar por vía subcutánea en el animal la solución de drogas pre anestésicas que se describen en el paso 2.2. Luego, se coloca el animal de nuevo en la jaula y espere hasta que aparezca el efecto sedante.
2. Coloque la rata en una cámara cerrada llena con 5% de isoflurano en el 100% de O _2, y esperar hasta que el ritmo respiratorio se ralentiza (alrededor de 30 segundos). A continuación, retire la rata de la cámara y colóquela en la mesa de la intubación.

4. Intubación orotraqueal

1. Acuéstese al animal en la espalda, a continuación, fije la cabeza colocando una correa unida a los dientes delanteros a la mesa.
2. Con una luz de fibra óptica, iluminar el espacio torácico. Luego, coloque un laringoscopio (o un encargo a uno, Jou et al. ²⁰ para más detalles) en la boca del animal. Visualizar las cuerdas vocales.
3. DeslizóE y colocar una guía orotraqueal en la tráquea (entre las cuerdas vocales). Deslice el tubo orotraqueal (16 g Tamaño del catéter) en la guía.
4. Retire la guía y comprobar con un espejo laríngeo colocado en el extremo del tubo orotraqueal para la presencia de humedad, lo que confirma la posición apropiada del tubo en la tráquea y no en el esófago.
5. Conectar el tubo a un ventilador de roedor (683 roedor ventilador, Harvard Apparatus) y ajustar la concentración de isoflurano al 2% (en 100% de O _2).
6. Asegure el tubo orotraqueal con cinta quirúrgica.

5. Cirugía Espinal

1. Colocar el animal en posición decúbito ventral sobre una placa quirúrgica climatizada, con la nariz apuntando al ángulo de 90 ° para el cirujano. Mantener la temperatura del cuerpo en torno a 37,5 ° C durante toda la cirugía.
2. Afeitar el cabello con tijeras entre las escápulas y quitar el pelo con una gasa.
3. Limpie la piel con betadine, y luego con 70% de alcohol. Repita este paso 3x.
4. Un pellizco del dedo del pie se realiza antes de inicio de la cirugía para asegurar la profundidad anestésica adecuada.   A continuación, realice una incisión en la piel rostro-caudal lateral con las tijeras entre los omóplatos.
5. Cortar el músculo acromiotrapezius rostro-caudal siguiendo el tendón para evitar el sangrado. Entonces disociar el músculo romboide para acceder a los músculos espinales (que rodean la vértebra).
6. Repliegue el músculo spinalis de C1 a C3 vértebra. La vértebra C2 es el uno con una apófisis prominente.
7. Limpie el músculo alrededor de la parte dorsal de la vértebra utilizando hisopos de algodón estériles.
8. Comience a retirar con cuidado la apófisis de C2 con una gubia. Luego, seguir meticulosamente hasta que se vea la parte dorsal de la médula espinal. Asegúrese de que la laminectomía es una laminectomía hemi dorsal. Preste especial atención a la duramadre que rodea la médula espinal, y las arterias en las proximidades de esta área.
9. Con # 55 pinzas, diseccionar rostro-caudalmente a lo largo de la duración C2, junto continuar lateralmente a cada lado rostral y caudal.
10. Esponja el líquido cefalorraquídeo.
11. Hacer una sección lateral bajo la raíz dorsal número cervical 2 con los micro tijeras. Compruebe con un bisturí micro que la extensión de la lesión es lo suficientemente cerca para llegar a la línea media de la médula espinal (véase la figura 2A para una vista dorsal de la lesión). Si no, entonces otro corte podría hacerse para completar la lesión. En caso de sangrado, use hisopos de algodón estériles. Tenga cuidado de no ir al lado contralateral, de lo contrario, el animal no se recupere de la lesión y tendrá una insuficiencia respiratoria.
12. La sutura de los músculos como una capa protectora y suturar de nuevo la piel. Limpie la herida con una gasa estéril Betadine saturado.
13. Turn-off del vaporizador isoflurano e inyectar los fármacos de reversión (atipamezol [500 mg / kg, im]), verifique la temperatura del cuerpo.
14. Cuando el animal comienza a respirar contra el ventilador,desconecte el tubo traqueal del ventilador y retire el tubo orotraqueal. Colocar el animal en una jaula climatizada para la recuperación.

6. El cuidado post-quirúrgico

Después de la cirugía, los animales son controlados continuamente para garantizar el mejor entorno posible para la recuperación. Los antibióticos (Baytril, 5 mg / kg), anti-inflamatorio (Carprofeno, 5 mg / kg) y la buprenorfina (50 mg / kg) medicamentos se administran cada 12 horas durante los primeros 2 días después de la cirugía para prevenir infecciones y reducir la ocurrencia del dolor post-operatorio. Las ratas tienen acceso ad libitum al alimento suave y agua (o agua gelificada para el 1 º día postoperatorio). Fluidos subcutáneos se pueden usar para prevenir la deshidratación en los primeros pocos días después de la operación. El peso corporal y la ingesta de alimentos son monitoreados diariamente. Su entorno se enriquece a través del experimento y el tiempo después de la lesión (doble carcasa, tubos en sus jaulas).

Resultados

Extensión de la lesión

El éxito y la reproducibilidad de este modelo experimental particular, dependen de la experiencia de cada manipulador / cirujano. La cantidad subsiguiente de recuperación de las vías respiratorias (la actividad del nervio frénico y la actividad de diafragma) después de una lesión C2 está correlacionada con la ventrolateral restante salvó la materia blanca ^21. Dado que la lesión es "hecho a mano" y requiere un poco de práctica por p...

Discusión

Dificultades técnicas de hacer el modelo de lesión C2

El modelo murino lesión C2 es una interesante herramienta para estudiar la neuroplasticidad respiratoria post-lesional. Sin embargo, los pasos necesarios para producir un modelo reproducible y fiable son numerosos y cada uno podría tener un impacto en el resultado del estudio. Por ejemplo, durante el proceso de intubación, un cuidado extremo debe ser tomada desde el tubo oro-traqueal puede producir una inflamación de la t...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Animal
Macho Sprague Dawley Rat	Janvier		225-250 g
Surgical Instruments
Student Pinza Dumont #5	Finas 91150-20
Pinzas de Patrón Estándar para Estudiantes Herramienta	Ciencias Finas 91100-12
Mayo-Stille Tijeras	Fine Science Tool	14013-15	Curvo
Student Vannas Spring Tijeras	Fine Science Tool	91500-09
Tijeras de resorte recto - 8 mm Cuchillas	Fine Science Tool	15025-10	Recto romo/romo
Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tool	16121-14
Cuchillo de disección curvo - punta fina	Fine Science Tool	10055-12
Portaagujas recto Olsen-Hegar	Herramienta de ciencia fina	12002-14
Retractor de Weitlaner-Locktite	Herramienta de ciencia fina	17012-11	2x3 Suturas quirúrgicas reabsorbibles romas
	Centravet	BYO001	Tamaño de sutura 4-0
Equipment
Hot Bead Steriliser	Fine Science Herramienta	18000-45
Catéter	Centravet	CAT188	16 G
Laringoscopio
Alambre
Espejo laríngeo	Centravet	MIR011
Timbres lactatados	Centravet	RIN020
Jeringa	Centravet Aguja Centravet
O2	Air Liquid	I1001M20R2A001
683 RodentT Ventilador 115/230V	Harvard Apparatus	55-0000
Vaporizador	WPI	EZ-155
Cama caliente de línea delgada	WPI	EZ-211
Bote de aire	WPI	EZ-258
Drugs
Carprofeno	Centravet
Rimadyl	Centravet	RIM011
Buprenorfina	Centravet	BUP001
Baytril	Centravet	BAY001
Dexmedetomidina	Centravet	DEX010
Atipamezol	Centravet	ANT201
Solución	de BetadineCentravet	VET002
Isoflurano	Centravet	VET066

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