Pruebas<em&gt; Drosophila</em&gt; El olfato con un ensayo del laberinto

Resumen

Se presenta una prueba de elección para revelar la influencia de sustancias odoríferas en el comportamiento de Drosophila utilizando un ensayo del laberinto.

Resumen

La detección de las señales del medio ambiente es esencial para los animales para asegurar su supervivencia. Para ello, utilizan señales ambientales tales como la visión, mecanorrecepción, el oído y chemoperception a través del gusto, por contacto directo oa través del olfato, el cual representa la respuesta a una molécula volátil que actúa en un mayor alcance. Moléculas químicas volátiles son señales muy importantes para la mayoría de los animales en la detección de peligro, una fuente de alimento, o para la comunicación entre individuos. Drosophila melanogaster es uno de los modelos biológicos más comunes para los científicos a explorar la base celular y molecular del olfato. Con el fin de resaltar las habilidades olfativas de este pequeño insecto, se describe un protocolo elección modificado basada en la prueba del laberinto en clásicamente utilizado con ratones. Los datos obtenidos con Y-laberintos dan información valiosa para comprender mejor cómo tratan los animales con su entorno permanentemente cambiante. Introducimos un protocolo paso a paso para estudiar laimpacto de los olores en mosca respuesta exploratorio utilizando este ensayo del laberinto.

Introducción

Quimiorrecepción a través del gusto o el olfato es una modalidad sensorial clave para la supervivencia de los animales. Se da señales vitales necesarias para la detección de un peligro o de las fuentes de alimentos, así como para las interacciones sociales. También ayuda a los animales a encontrar un socio necesario el sexo para su reproducción. Durante más de 20 años, la investigación intensiva, incluyendo el premio Nobel de obra de Richard Axel y Linda Buck en 2004 "por sus descubrimientos de los receptores odorantes y la organización del sistema olfativo", se ha llevado a cabo para revelar las bases moleculares y celulares de la olfacción ^1,2.

Uno de los modelos animales preferidos por los científicos para diseccionar la percepción olfativa es D. melanogaster. Este insecto comparte una estrategia de codificación de olor celular y molecular similar con mamíferos. La comunidad científica utiliza diversos paradigmas de comportamiento para estudiar el papel de los odorantes en esta mosca de la fruta. Estas pruebas incluyen ensayos multimodales como courtshipruebas p donde diversas modalidades sensoriales, incluyendo el olfato, son importantes para obtener el cortejo masculino ^3. Otros ensayos también se han desarrollado para abordar el papel de los odorantes más específicamente; estos incluyen T-laberintos, Y-laberintos, ensayos de trampa, arenas de cuatro de campo y ^4.5.6.7.8 viento túneles.

En este artículo se presenta un ensayo del laberinto sencillo modificado, que proporciona respuestas olfativas robustas usando D. melanogaster. Nuestra puesta a punto utiliza-tips finales en contra de un método descrito anteriormente ^9. Por lo tanto, nuestra laberinto Y tiene dos ventajas. En primer lugar, evita las subidas en el sistema una vez que la marcha ha hecho su elección. En segundo lugar, limita el intercambio de olores en todas las áreas de el laberinto. Esta última ventaja es importante, ya que de Drosophila son muy sensibles al flujo de aire que se utiliza a menudo para evitar la saturación odorante. Para ajustar el montaje experimental con un flujo de aire sería consume tiempo y costo. Por lo tanto, nuestro ensayo del laberinto representa un efciente y rápida para poner a prueba el rendimiento olfativo de Drosophila.

Protocolo

1. Antes de empezar

1. Utilizar una referencia de valores isogenized teniendo fenotipos conductuales estables y robustas. No existe una regla general para la elección de esta población, ya que todos los controles posibles pueden llevar heterogéneos alelos de fondo.
2. Utilice esta cepa de control para retrocruzar cada dos valores necesarios para los pasos posteriores. Este paso retrocruzamiento se representa típicamente por lo menos 5 cruces sucesivos de una sola hembra virgen (para permitir que sea posible entrecruzamiento entre cromosomas homólogos) a 2-3 machos de referencia isogénicas ^5. Este paso es importante para homogeneizar el fondo genético entre las diferentes poblaciones de la mosca.
3. Mantener las poblaciones de Drosophila en una harina de maíz estándar (9%), levadura (10%), y el medio de agar (1,5%) complementado con antibióticos (0,4% de metil para-hidroxi-benzoato) en un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas a 25 ° C.
4. Lograr experimentos quimiosensoriales en una habitación con temperatura controlada (25 º C) con luz roja lejana(Para eliminar la contribución de las señales visuales, y centrarse en las señales quimiosensoriales). Regularmente renovar el aire de la habitación a ventilar el área entre cada experimento.

2. Respuesta olfativa mediante un ensayo del laberinto

1. Morir de hambre a las moscas de 16-18 horas a 25 ° C en tubos de vidrio que contienen una toalla de papel húmeda antes de la prueba.
2. Únase a un conector en forma de Y a dos viales de vidrio y un vial de plástico pequeña (carga vial). Utilice 1 ml puntas de pipeta que pasan a través de los tapones de espuma para unir el conector a los tres viales, y para obtener un laberinto Y cerrado herméticamente. Cortar los extremos estrechos de dos puntas de pipeta (~ 2 mm de diámetro, para evitar cualquier retorno de la marcha una vez que ha tomado su decisión) para formar dos viales "atrapar", y un gran final de una punta de la pipeta para formar la "carga" tubo (Figura 1A).
3. Justo antes de la conexión de los viales "atrapar" (fig. 1B), coloque una ~ 6 mm de diámetro en el papel de filtrocada vial. Añadir 40 l de solución de odorante en una de papel de filtro, y 40 l de la correspondiente disolvente en el segundo papel de filtro.
4. Introducir diez 4-9 moscas de un día en el vial de "carga". No utilice CO ₂ anestesia durante esta transferencia, ya que tiene un fuerte efecto sobre el comportamiento ^10. Más bien utilizar breve enfriamiento en hielo. La manipulación adecuada de las moscas anestesiadas es importante limitar el estrés en los temas tanto como sea posible.
   1. Lleve a cabo una serie de pruebas del laberinto a 25 ° C bajo luz roja lejana (el uso de bombillas LED para limitar la posible fuente de calor) para evitar los estímulos visuales tanto como sea posible. Tenga cuidado de alternar las orientaciones de los Y-laberintos (tubo odorante que contiene a la izquierda, oa la derecha, y el tubo de carga en el frente o en la espalda; Figura 1C).
   2. Permita que transcurran varias horas para que las moscas entren en el vial que contiene la trampa odorizante o el disolvente. Cuente moscas después de 24 horas para aumentar la participatien un máximo de más de 80% y proporcionar el valor de índice olfativa máxima (Simonnet, comunicación personal).
   3. Calcular el índice olfativa resultante usando la siguiente fórmula: (número en el tubo de olor - número en el tubo de disolvente) / número total de moscas cargados.
5. Lave laberinto Y puesta a punto de la siguiente manera: remoje la desmantelado configuración en RBS 35 MD durante la noche. Enjuagar bien con agua del grifo. Por último, enjuagar con agua desionizada y dejar que se seque.

3. Análisis Estadístico de los Datos

1. Lleve a cabo una prueba t, un ANOVA de una vía o un ANOVA de dos vías en función de los datos y variables.

Resultados

Figura 1D muestra dos respuestas representativas utilizando este ensayo del laberinto. Cantón-S machos evitan fuertemente 10% de ácido acético diluido en agua destilada, mientras que no evitan significativamente ácido fenilacético 10%. Estos ensayos se basan en 10 varones por réplica colocados juntos en los viales de carga. Este protocolo a veces puede conducir a grandes errores estándar de la media. Si es necesario, es posible reducir este inconveniente mediante el uso de 20 hombres por repeticiones en...

Discusión

Nuestro protocolo laberinto Y se basa en un protocolo previamente descrito ^9. Sin embargo, se introducen dos grandes diferencias. En primer lugar, utilizamos puntas de pipeta estrechos para evitar que las moscas de regresar una vez que deciden entrar en el vial que contiene el disolvente o el disolvente más el odorante. Estos consejos estrechos también son útiles para limitar la difusión de aroma en el laberinto. En segundo lugar, se utiliza un vial de carga menor a la fuerza a las moscas para entrar en el la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Drosophila Tubo de poliestireno	VWR europe	734-2255	30 x 25 mm  Y-maze
Drosophila Tubo de borosilicato	Dijon verre		95 X 25 mm Y-maze Tapón
espuma	Dutscher	999038	Y-maze Conector
forma de Y	Europrix	11020605	Y-maze
100-1.000 µ l puntas	de pipeta Corning	4868	Conecte las siguientes puntas de pipeta al conector en forma de Y. Corte 2 puntas de pipeta a 65 mm del extremo ancho y conecte el extremo estrecho (con un ∼ Apertura de 2 mm) a 2 viales de prueba. Estas aberturas limitarán los cambios de sentido una vez que las moscas ingresen a los tubos que contienen los olores. Corte 1 punta de pipeta a 35 mm del extremo ancho y conéctela al vial de carga. Y-maze
Bombilla LED Rojo Lejano	Rubin-Lacaque	0RB180238	625-630 nm
Ácido Acético	Sigma-Aldrich	45725
Ácido Fenilacético	Sigma-Aldrich	P16621
Sabores	sensibles a la levadura Harina de
	eurogerm	Farine de maï s
Agar	Kalys	HP-697-25
Hidroxi metil 4 benzoato	VWR International 25605293

de en maíz de Estrasburgo 1018880464