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Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

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DOI:

10.3791/51243

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21 de junio de 2014

 , 
1Muscle Development and Regeneration Program, Sanford-Burnham Institute for Medical Research, 2IRCCS Fondazione Santa Lucia

En este artículo

Resumen

Aquí, se describe un protocolo basado en la reprogramación epigenética de células madre embrionarias humanas (hESCs) hacia la generación de una población homogénea de células progenitoras del músculo esquelético que bajo condiciones de cultivo permisivas formar grupos tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres), que recapitulan las características biológicas de la humana los músculos esqueléticos.

Resumen

Generación de una población homogénea y abundante de células del músculo esquelético a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) es un requisito para las terapias basadas en células y por una "enfermedad en un plato de" modelo de las enfermedades neuromusculares humanos. Obstáculos importantes, como la baja abundancia y heterogeneidad de la población de interés, así como la falta de protocolos para la formación de estructuras contráctiles tridimensionales, han limitado las aplicaciones de las células madre para trastornos neuromusculares. Hemos diseñado un protocolo que supera estos límites por introducción ectópica de factores definidos en hESCs - el factor de MyoD determinación muscular y SWI / SNF remodelación de la cromatina BAF60C componente complejo - que son capaces de reprogramar hESCs en las células del músculo esquelético. A continuación se describe el protocolo establecido para generar mioblastos hESC-derivados y promover su agrupación en estructuras miniaturizadas tridimensionales (myospheres) que imitan funcionalmente músculos esqueléticos miniaturizados 7

Introducción

Debido a su capacidad única de auto-renovación, manteniendo la pluripotencia, las células madre embrionarias humanas (hESCs) se consideran un recurso muy valioso en la medicina regenerativa. Generación de células madre de repoblación mediada de músculos enfermos y células hESC-o madre pluripotentes inducidas (IPSC) derivada de los músculos esqueléticos para el modelado de la enfermedad in vitro son objetivos principales de los estudios dirigidos a la identificación de tratamientos y elucidar la patogénesis de muchas enfermedades neuromusculares. Sin embargo, estos estudios han sido cuestionados por la resistencia de hESCs para convertir a las células musculares esqueléticas y por la escasez de información sobre la regulación molecular de células madre-compromiso hacia miogenia esquelético. De hecho, los intentos previos para generar células progenitoras de músculo esquelético de hESCs revelaron que sólo el cuerpo embrioide progenie (EB) o derivados de células mesenquimales son competentes para activar miogenia esquelético siguiente expresión ectópica de activadores de la transcripción (por ejemplo,Pax3 o Myf5) 1-3 o por la exposición a condiciones de cultivo específicas 4-5.

Hemos demostrado anteriormente que el componente SWI / SNF, BAF60C (codificada por SMARCD3), es un componente esencial de la maquinaria transcripcional que permite la activación MyoD mediada de loci muscular específica 6. Recientemente hemos descubierto que la ausencia selectiva de BAF60C confiere a hESCs la resistencia a la activación mediada por MyoD de la miogénesis esquelético 7 que se observa lo contrario en BAF60C expresando células somáticas 8-10, un proceso comúnmente referido como conversión miogénica. La expresión forzada de BAF60C permite MyoD para activar directamente miogenia esquelético en hESCs, de las condiciones específicas de cultivo, con BAF60C y MyoD imponer una firma epigenética que compromete hESCs hacia el linaje miogénico 7. Es de destacar que el análisis proteómico anterior reveló la ausencia selectiva de BAF60C, entre los componentes de SWI / SNF, en los CES 11. Se utilizó este conocimiento para imponer un compromiso epigenética de hESCs en el linaje miogénico, que conduce a la generación de una población homogénea de mioblastos esqueléticos que podrían ser agregados para formar contráctil tridimensional estructuras (myospheres) que los músculos esqueléticos miniaturizados funcionalmente imitan 7. De hecho, nuestro método de generación de los progenitores del músculo esquelético de hESCs depende del compromiso epigenética de hESCs al linaje miogénico, que es fenotípicamente latente hasta que las células están expuestas a las señales de diferenciación, tales como células la agregación y la cultura en medio de diferenciación (ver protocolo específico). Esta estrategia permite la expansión de una población homogénea de hESCs que se epigenéticamente comprometida con el linaje del músculo esquelético y adecuado para la formación de myospheres contráctiles tridimensionales que recapitular histológico y propiedades funcionales de esqueléticomúsculos. Los myospheres proporcionan la primera evidencia de los músculos miniaturizados explotables para una "enfermedad en un plato de" modelo de las enfermedades musculares. Cuando generada a partir de derivados de pacientes CMPI, estos myospheres tienen el potencial para dilucidar preguntas de desarrollo de muchos años y la patogénesis de enfermedades raras, además de ofrecer el tremendo potencial como herramienta de cribado de alto rendimiento de compuestos terapéuticos. También tomamos nota de que una lectura inmediata de myosphere análisis podría ser proporcionada por inmunohistoquímica en secciones, como se describe en el protocolo JoVE por Gomes et al. 12

Protocolo

1. Infección de hESCs

Este protocolo requiere alta lentivirus titulación codificación BAF60C y MyoD 13. Estas construcciones están disponibles bajo petición.

  1. Recomendaciones antes de comenzar
    1. Con el fin de garantizar una alta eficiencia de infección, hESCs placa para la infección en condiciones libres de alimentador (Figura 2A) para eliminar competidores celulares durante la absorción viral. De hecho, MEFs son notoriamente más fácil de infectar el mayor en comparación con hESCs y son competentes para la conversión MyoD mediada. Por lo tanto, la eliminación de los cultivos MEFs células madre aumenta la tasa de infección.
    2. Se recomienda tener lentivirus alto título para asegurar una alta eficiencia de infección. Opciones para mejorar la eficiencia de la infección se describen en la sección "comprobar la infección".
    3. Prepare placas Matrigel recubierto mediante la adición de 1 ml de 1 mg / ml de Matrigel en cada pocillo y dejar por lo menos 1 hora a temperatura ambiente (o O / N selló a 4 ° Csi se prepara el día anterior).
  2. Procedimiento Infección
    1. Día antes de la infección
      1. Añadir HES de la célula Clonación y Suplemento de recuperación en el medio a 1000 X de dilución (2 mM de concentración final).
    2. Día 0 - Infección por BAF60C
      Nota: Realizar la infección de hESCs con BAF60C primero seguido por la infección con MyoD.
      1. Disociar un pocillo de una placa de 6 pocillos de hESCs crecido como colonias 14 en una suspensión de células individuales por incubación con 1 ml de TrypLE durante 5 min a 37 ° C.
      2. Transferencia de suspensión a un tubo de 15 ml, añadir 9 ml de medio de células madre y centrifugar durante 5 min a 1200 rpm.
      3. Durante la centrifugación, preparar la mezcla infección en un tubo limpio mediante la adición de 1 ml de mTeSR1, polibreno (6 mg / ml) y HES de la célula Clonación y Recuperación Suplemento (2 mM).
      4. Vuelva a suspender el sedimento celular (5 -1 x 10 6 células de aproximadamente 5 x 10 de un confluent bien de hESCs) con 1 ml de la mezcla de la infección y la placa sobre una placa de fijación de 6 pocillos baja, lo que impide que las células se adhieran al plástico.
      5. Agregar virus BAF60C-IRES-GFP en 10 8 MOI e incubar 3 horas en la incubadora
      6. Recoger la suspensión celular que contiene los virus y dividir por igual en dos pozos matrigel recubiertos. A continuación, añadir 2 ml de mTeSR1 + hES celular clonado y Recuperación Suplemento a cada pocillo y dejar O / N en la incubadora.
    3. Día 1
      1. Retire con cuidado el medio que contiene el virus y reemplazar con 2 ml de mTeSR1and hES celular clonado y Suplemento de recuperación. Las células se iniciará la formación de grumos como se muestra en la Figura 2B.
    4. Día 2 - Infección por MyoD
      1. Antes de continuar compruebe el estado de la fluorescencia de las células bajo un microscopio de fluorescencia para asegurarse de tener una alta eficacia de la infección. Si no es así, consulte la sección "comprobar infectarde iones ".
      2. Si las células han alcanzado al menos el 80% de confluencia, proceda de la siguiente manera; de lo contrario esperar a que un día adicional antes de continuar.
      3. Retire el medio y agregar 1 ml de reactivo TrypLE para disociar las células. Incubar 5 minutos a 37 ° C.
      4. Repetir como from1.2.2.2 descrito - 1.2.2.6 añadiendo virus MyoD a 10 8 MOI.
    5. Día 3
      1. Retire con cuidado el medio que contiene el virus y reemplazar con 2 ml de mTeSR1and hES celular clonado y Suplemento de recuperación.
      2. MEFs Plate sobre matrigel recubren placas a 2,5 x 10 5 / cm 2 para el día siguiente para permitir la propagación de las células infectadas.
    6. Día 4
      1. Retire el medio y agregar 1 ml de reactivo TrypLE para disociar las células. Incubar 5 minutos a 37 ° C.
      2. Transferencia de las células en un tubo Falcon de 15 ml, añadir 9 ml de medio de células madre y centrifugar durante 5 min a 1200 rpm.
      3. Remove el sobrenadante y volver a suspender en 6 ml de medio de células madre.
      4. Retire el medio de la placa de 6 pocillos MEFs contienen y hESCs placa a 01:02 relación de división, dispensación 3 ml por cada MEFs contienen también.
        Sugerencia: Cuando las colonias alcanzan la confluencia, algunos de los pozos de células MyoD/BAF60C-infected se pueden congelar en nitrógeno líquido como existencias de reserva. Medio de congelación incluye el 90% de KOSR y DMSO al 10% más el 2 mM hES celular clonado y Suplemento de recuperación. Los pozos restantes pueden entonces expuestos al protocolo de diferenciación - vea abajo para la descripción. Si se necesitan más células para producir más myospheres, hESCs infectadas se pueden propagar adicionalmente como sigue:
      5. Se retira el medio y se incuba con 1 ml de 1 mg / ml de colagenasa IV durante 5 min a 37 ° C.
      6. Retire la colagenasa IV y agregar 1 ml de medio de células madre.
      7. Bajo un microscopio de disección raspan las colonias con una punta de 10 ml.
      8. Recoge los pedazos de la colonizaciónES en un tubo de 15 ml y permitir sedimentar durante 3 min. A continuación, retire el sobrenadante, resuspender en medio de células madre y la placa sobre placas MEFs utilizando una relación 1:4.
  3. Comprobación de la infección
    1. Al difundir las células, se recomienda a la placa de las células infectadas en una escala más pequeña de la cosecha para el análisis de ARN y realizar análisis de la expresión de proteínas por inmunofluorescencia para detectar biomarcadores que reflejan la situación biológica correcta en cada fase (ver resultados representativos). Para lentivirus de alto título el porcentaje de células infectadas esperados debe ser al menos 80%.
    2. Para garantizar una alta eficiencia, los vectores lentivirales se pueden modificar, la introducción de un marcador de selección fluorescente y / o una resistencia a los antibióticos. Nuestra plásmido lentiviral que expresa BAF60C también lleva a la fluorescencia de GFP.
    3. Clasificación hESCs para un marcador fluorescente. En el caso de la baja eficiencia de la infección se recomienda el uso de la fluorescencia de unacélulas ctivated (FACS-clasificación) para enriquecer las células que expresan virus BAF60C y luego infectar a las células con virus MyoD alto título.
      1. Añadir hES celular clonado y Suplemento de recuperación a medio día antes de la clasificación.
      2. El día de la clasificación, se disocian las células por TrypLE (como se describe en el día 0) y resuspender las células en el suero de reemplazo KO más hES celular Clonación & Recovery Supplement en FACS tubos.
      3. Al final de la clasificación, recoger las células en el suero de reemplazo KO y placa sobre placas de MEFs la adición de HES de la célula Clonación y Suplemento de recuperación.

2. EB-como Inducción y Diferenciación

  1. Inducción y diferenciación procedimiento
    1. Día 0 - EB inducción
      1. Asegúrese de que, antes de iniciar la diferenciación de hESCs BAF60C/Myod-infected, que tienen un alto número de colonias en el pozo (Figura 2C).
      2. Para cada bien remove el medio, se lavan con PBS y añadir 1 ml de 1 mg / ml de colagenasa IV. Incubar durante 5 min a 37 ° C.
      3. Retire colagenasa y añadir 1 ml de medio de EB.
      4. Bajo un microscopio de disección rápidamente se disocian mecánicamente las colonias en 400-800 agregados de células raspando con una punta de 10 ml.
      5. Recoger los trozos de colonias en un tubo de 15 ml y se deja sedimentar durante 3 min. Eliminar el sobrenadante, resuspender en 3 ml de medio de EB y transferir la suspensión celular a un pocillo de una placa de 6 pocillos bajo apego.
    2. Día 1
      1. Compruebe el tamaño de las colonias y la muerte de las células antes de proceder. Si grandes trozos están presentes, las dividen pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 5 ml, 3-4 veces. Si la muerte de las células es muy elevada (muchas células flotantes y escombros) reemplazan el medio mediante la recopilación de los agregados en un tubo de 15 ml por la gravedad y la placa con 3 ml de medio fresco EB, de lo contrario, proceda como sigue.
      2. Añadir 1,5ml de medio fresco EB en los pozos
    3. Día 2
      1. Cambiar el medio mediante la recopilación de los agregados de los pocillos en un tubo de 15 ml. Deja que se establecen durante 2 min.
      2. Eliminar el sobrenadante, sustituir con 3 ml de medio fresco EB y redistribuir en los mismos pozos.
    4. Día 3
      1. Añadir 1,5 ml de medio fresco EB en los pozos.
    5. Día 4
      1. Proceda como se describe en el "Día 2".
    6. Día 5 - diferenciación miogénica de clusters EB-como (Figura 2D).
      1. Recoger los agregados como se describe en 2.1.3.1 y lavar una vez con 2 ml de PBS; permiten el agregado de sedimentos.
      2. Retire PBS y añadir 3 ml de medio MS; Placa en los mismos pozos.
    7. Día 6 - Día 20
      1. De D6 a D20 sustituir el medio con medio fresco cada 3 días. Myospheres representativos se muestran en Figura 2E.
  2. Comprobación de la diferenciación myosphere
    1. Antes de continuar, se recomienda comprobar la eficacia de la diferenciación miogénica dentro de los myospheres haciendo secciones de los myospheres incrustados en compuesto OCT, como se describe en el protocolo anterior Jove 12. Realizar una tinción de inmunofluorescencia de marcadores miogénicos como myognenin (F5D clon, DSHB) y de la cadena pesada de miosina (MF20 clon, DSHB) (ver resultados representativos).
      SUGERENCIA Para tener éxito con la tinción para miogenina en secciones EB es crítico para llevar a cabo la recuperación de antígeno mediante tratamiento con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,5% durante 5 min. Además, es posible utilizar este protocolo para la doble tinción utilizando anticuerpos F5D y MF20.

3. Recetas Medios

  1. Medio ESC
    DMEM-F12
    1 mM de L-glutamina
    20% Knockout Serum medio de sustitución (KOSR)
    0,1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA)
    50 U / ml de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep)
    0.1 mM de beta-mercaptoetanol
    8 ng del factor de crecimiento / ml de fibroblastos básico (bFGF)
  2. Medio EB
    DMEM F12
    1 mM de L-glutamina
    15% de FBS
    5% de suero de caballo
  3. Medio DM
    DMEF F12
    Suplemento 1X SU Liquid Media
    1X N-2 Suplemento

Resultados

Figura 1A muestra un esquema del protocolo propuesto para generar myospheres de hESCs. Los pasos críticos con el control (indicadas por las flechas) son la eficiencia de la infección en hESCs y la conversión miogénica dentro de los myospheres.

En nuestros experimentos nos aprovechamos de un vector lentiviral que codifica BAF60C que lleva la fluorescencia de GFP. Nos suele infectar a las células con BAF60C y FACS-tipo 72 horas después de la infección para enriquecer a la población expresar BAF60C. Cuando las células alcanzan alrededor de un 70-80% de confluencia, se infectan con lentivirus MyoD. Después de la primera infección que se necesita normalmente dos o tres días para las células para alcanzar esa confluencia.

La Figura 1B muestra los niveles de expresión de los genes exógenos como veces de inducción con respecto a hESCs no infectadas. Figura 1C muestra la expresión y distribución a nivel de proteínas de los factores introducidos. BAF60C expresión se muestra como la fluorescencia de GFP, mientras que la expresión de MyoD se detecta por inmunofluorescencia con un anticuerpo MyoD. Consideramos Día 0 el día que empezamos la diferenciación de hESCs infectados en agregados EB-como. Después de 15 días en medio DM, una parte de los myospheres (generalmente un todo bien) está incrustado en compuesto OCT 12 y seccionada para llevar a cabo inmunofluorescencia para marcadores miogénicas para comprobar la eficiencia de conversión miogénica. Figura 1D muestra la tinción representativa para miogenina y la miosina de cadena pesada en una diferenciación miogénica óptima. Myospheres pueden tener diferentes formas o inusuales, tal vez como resultado de la fusión con myospheres más pequeñas. A partir del día 10, es posible observar la contracción esporádica en los myospheres (ver la película 1 y 2).

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Figura 1. A) Esquema del protocolo utilizado para la generación de myospheres de hESCs. B) los niveles de mRNA de los genes exógenos en hESCs infectadas con BAF60C y MyoD (H9-BM) supervisado por QRT-PCR y se expresó como veces de inducción, como se en comparación con burlarse hESCs infectados imágenes (H9-CTR). C) que muestran tinción de inmunofluorescencia MyoD (rojo) y fluorescencia BAF60C (verde) debido al elemento IRES-GFP en el vector. D) Inmunofluorescencia realiza en myosphere secciones teñidas para Miogenina (MYOG ), la cadena de miosina pesada (MyHC) y counterstained para DAPI (véanse los detalles de inmunofluorescencia). La barra de escala es de 100 micras.

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Figura 2. Imágenes representativos de la apariencia de células en diferentes etapas de laprotocolo de la infección (parte I) a la diferenciación (parte II). Barra de escala es de 100 micras. Considerando que las estructuras EB-como D1 a D5 son en su mayoría de forma circular (D), myospheres cultivadas durante 15 días según el esquema de la figura 1A presenta una forma impredecible y son heterogéneos en cultivo; ver dos ejemplos en E y F.

Discusión

El protocolo propuesto aquí se describe cómo generar agrupaciones tridimensionales de miofibras contráctiles (myospheres) directamente desde hESCs. La estrategia propuesta tiene el potencial sin precedentes y extraordinaria para producir las mini músculos en suspensión que pueden ser adecuados como una "enfermedad en un plato de" modelo para los ensayos de cribado y estudios de desarrollo. Por otra parte, el método para generar myospheres de hESCs es sencillo y no requiere ningún paso de FACS de clasificación durante la diferenciación, que típicamente tiene un impacto negativo en el rendimiento de células recuperadas. Además, un procedimiento de clasificación durante la diferenciación podría interferir con la agregación, ya que implica una disociación de la JE en células individuales.

El método propuesto se basa en la reprogramación epigenética de hESCs con factores específicos, MyoD y BaAF60C, que no se expresan en las células madre embrionarias pluripotentes. MyoD y BAF60C proporcionan el "núcleo" de proteínas th complejoen marcas de los loci genómico a partir de la cual la transcripción procede a activar el programa miogénica esquelético. Los dos factores se entregan a las células por medio de las infecciones de lentivirus y por lo tanto es crítico para obtener una alta eficacia de la infección de ambos factores en todas las células. Esto se puede lograr mediante el uso de virus de alto título o virus dotados de marcadores de selección. Condiciones de cultivo también juegan un papel importante en la optimización de la extensión de la diferenciación miogénica. Proponemos un protocolo de diferenciación basado en suero para la diferenciación de MyoD/BAF60C expresar hESCs en grupos de precursores miogénicas, seguido de incubación en medio definido libre de suero (que contiene transferrina insulina - SU) para lograr la conversión de los precursores miogénicas en miotubos esqueléticos. Sin embargo, es posible que otros medios definidos pueden lograr una diferenciación miogénica igual o mejor. Una limitación actual del protocolo es que se basa en el uso de suero bovino fetal, que, contiene ademásing muchas proteínas y sustancias de origen animal, muestra las variaciones de lote a lote. Esto puede resultar en una menor eficiencia o heterogeneidad de conversión miogénica dentro myospheres. Es de destacar que no todas las estructuras EB-como derivados de BAF60/MyoD-expressing hESCs son myospheres; es decir, algunos son agregados EB-como totalmente compuestas de fibras musculares. El número de myospheres normalmente derivadas de hESCs que expresan BAF60C y MyoD puede variar de 30 a 60% según lo estimado mediante inmunotinción sobre secciones EB realizó al final del protocolo (ver resultados). Un enfoque potencial para enriquecer a una placa de cultivo sólo myospheres sería el uso de un reportero miogénico. Esto facilitaría descartando los grupos EB-como diferenciados parcialmente o no, y seleccionar sólo los myospheres.

Por último, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a los requisitos temporales de los factores introducidos sería útil para mejorar el método de entrega. Por ejemplo, si BAF60C y MyoD se requieren sólo para SHtiempo ort "patear" las células en la dirección correcta, se podría aplicar métodos basados ​​en la entrega ARNm modificado. Por el contrario, si se necesitan los factores para un tiempo más largo antes de que las células explotan sus proteínas endógenas, un enfoque episomal se recomienda para eliminar la variabilidad y efectos incontrolados debido a la integración en el genoma. Finalmente, observamos que es obligatorio para expresar BAF60C antes o al mismo tiempo como MyoD (nunca después) con el fin de lograr la conversión células madre en los músculos esqueléticos. El requisito previo para la expresión de BAF60C presumiblemente se basa en su papel en el pre-establecer el paisaje epigenético para la distribución adecuada de la cromatina a través de la MyoD genoma 6,15. Como tal, los futuros protocolos podrían mejorarse por compuestos u otras manipulaciones que estimulan la expresión BAF60C en hESCs.

Divulgaciones

No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

PLP es un Investigador Asociado del Centro de Investigación en Salud de Sanford Children. Este trabajo ha sido apoyado por las siguientes subvenciones a PLP: R01AR056712, R01AR052779 y P30 AR061303 del Instituto Nacional de / Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de la Salud (NIAMS), MDA y Sanford Children Premio de Investigación en Salud. Este trabajo se ha beneficiado en parte de financiación de la investigación a partir del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea en el proyecto FP7-Health - 2009 ENDOSTEM 241440 (activación de las células madre asociadas vasculatura y las células madre de músculo para la reparación y el mantenimiento del tejido muscular) SA fue apoyada por. comunión CIRM.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 6 pocillosCorning3506
Placa de fijación baja de 6 pocillosCorning3471
GFR MatrigelBD Biosciencies356231
MEFs (crecimiento detenido)14
Colagenasa IVInvitrogen17104-019
DMEM-F12Invitrogen15-090-CV
KOSRInvitrogen10828-028
1 mM L-glutamina (100X)Invitrogen35050-61
Pen/Estreptococo (100X)Invitrogen15070-063
2-MercaptoetanolInvitrogen21985-023
NEAA (100X)Invitrogen11140-050
PolybreneMilliporeTR-1003-G
ITS Suplemento de medios líquidosSigmaI3146
N2-suplemento Invitrogen17502-048
TrypLE expressInvitrogen12605-010
FBSHyCloneSH30396.03
HSInvitrogen16050114
hES Clonación de células & Suplemento de recuperaciónStemgent01-0014-100
bfgfSigma4114-TC
mTeSR1Stemcell Technologies5850
Anti-MyoDBD Biosciences554130
Anti-MyHCDSHBMF20
Anti-miogeninaDSHBF5D

Referencias

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