Aquí describimos el proceso de inmunotinción de montaje completo de antenas de Drosophila, lo que nos permite comprender mejor los mecanismos moleculares involucrados en la diversificación de las neuronas receptoras olfativas (ORN).
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Artículo de método
Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el
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Resumen
Resumen
Las moléculas odoríferas se unen a sus receptores diana de una manera precisa y coordinada. Cada receptor reconoce una señal específica y transmite esta información al cerebro. Como tal, la determinación de cómo se transfiere la información olfativa en el cerebro, tanto la modificación de la percepción y comportamiento, investigación méritos. Curiosamente, hay más pruebas de que los factores de transducción celular y la transcripción están implicados en la diversificación de la neurona olfativa del receptor. Aquí les ofrecemos un conjunto robusto de montaje método de marcaje inmunológico para ensayar in vivo organización neurona olfativa del receptor. Usando este método, se identificaron todas las neuronas olfativas del receptor con el anticuerpo anti-ELAV, un marcador pan-neuronal conocido y Or49a-mCD8 :: GFP, una neurona olfativa del receptor expresa específicamente en Nba neurona utilizando anticuerpo anti-GFP.
Introducción
El sistema olfativo se utiliza para distinguir entre una inmensa variedad de moléculas de olor y posteriormente enviar la información resultante a los centros superiores del cerebro. Esta entrada se utiliza para controlar con precisión los comportamientos animales fundamentales, como la alimentación y el apareamiento 1-6. Como cada tipo de neurona olfativa está asociado a un conjunto específico de los olores, la diversificación de las neuronas receptoras olfativas (ORN) s es esencial para la función del sistema olfativo adecuada 7.
Genética de Drosophila, nos permite llevar a cabo la investigación solo nivel....
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Protocolo
1. Preparar plato Manzana
- Mezclar 12,5 g de agar, 125 ml de jugo 100% disponible en el mercado de la manzana, 12,5 g de glucosa, y 375 ml de H 2 O. Microondas la mezcla durante 1 a 2 minutos y se vierte a la placa de cultivo de 3 cm de células. Almacenar a 4 ° C.
2. Cruzamiento genético
- Utiliza el siguiente cruce genético representativo:
Or49a-mCD8 :: GFP / CyO x w 1118
3. Protocolo de disección y la tinción
- Se anestesia la marcha y luego se corta la cabeza mosca vertical sujetándolo mediante un fórceps.
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Resultados
Garantizar que tanto la disección y fijación se realizan con rapidez es un factor clave para lograr el éxito con este protocolo. El uso de finas tijeras y pinzas también es crucial. Después de la inmunotinción, las antenas fluorescentes marcadas se examinaron bajo un microscopio confocal. Normalmente nos tomamos secciones 1μm usando una lente de 20x. Hemos marcado Nba 7 ORNs utilizando Or49a-mCD8 :: GFP y contamos el número de Nba ORNs de tipo salvaje antena. El reportero mCD8-GFP se localiza membrana celular.......
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Discusión
La disección de la antena de Drosophila se describe es simple y fácil de realizar en un entorno de laboratorio. Para garantizar una disección éxito, es esencial utilizar las tijeras bien afiladas. Mientras que la inmunotinción la antena diseccionado, es importante incubar en un recipiente lleno de humedad para evitar la evaporación de la solución de anticuerpo. La antena diseccionado tiene una tendencia a flotar en la solución. Uso de 0,1% de Triton en PBS durante la fijación y el bloqueo de pasos facilitará la.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por el programa apoyado por el MEXT para la Fundación para la Investigación Estratégica en las Universidades Privadas y JSP Young Scientist B subvención para HT Nos gustaría dar las gracias a Ohtake Norihito para editar los clips de vídeo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio de disección Stemi DV4 | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Placas de cultivo con fondo de vidrio | Corporación MatTek | P35G-0-10-C | |
| Tijera de disección | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Rata anti-ELAV | Estudios del desarrollo Banco de hibridoma | 7E8A10 | Dilución 1:200 |
| Ratón anti-GFP | Invitrogen | A11122 | Dilución 1:400 |
| Burro Anti-Conejo IgG Jackson | ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Dilución 1:200 |
| Burro Anti-Rata IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Dilución 1:200 |
Referencias
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1....
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Reimpresiones y permisos
