Biology

从成年小鼠切牙牙源性上皮干细胞的分离和培养

Published: May 1, 2014 doi: 10.3791/51266

Miquella G. Chavez^1,2, Jimmy Hu¹, Kerstin Seidel¹, Chunying Li^1,3, Andrew Jheon¹, Adrien Naveau^4,5,6, Orapin Horst^1,7, Ophir D. Klein^1,8

¹Department of Orofacial Sciences and Program in Craniofacial and Mesenchymal Biology, University of California, San Francisco, ²Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, ³Department of Pathology and Research Center, Zhongshan Hospital of Dalian University, ⁴Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, UMR S872, ⁵Centre de Recherche des Cordeliers, Université Pierre et Marie Curie, UMR S872, ⁶INSERM U872, ⁷Division of Endodontics, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California, San Francisco, ⁸Department of Pediatrics and Institute for Human Genetics, University of California, San Francisco

Summary

不断增长的鼠标切牙提供了一个模型，以研究牙源性上皮干细胞（DESCs）牙齿组织的重建。一个强大的系统，从切牙持续，可靠地获得这些细胞，并扩大它们在体外这里报道。

Abstract

了解背后牙齿再生和更新的细胞和分子机制已成为极大的兴趣^1-4个主题，鼠标切牙提供了一个模型，这些过程。这一显着的器官在整个动物的生命持续增长，并产生所有从容纳在阴唇（朝向唇）和舌（朝向舌）颈环（CL）的区域的成体干细胞的活性池所需的细胞类型。只有从阴唇CL中的牙齿干细胞生成搪瓷，牙齿的外壳，在唇面釉细胞产生。这种不对称的釉质形成允许磨损在切牙尖，和祖细胞和干细胞在近端门齿确保牙齿组织正在不断地补充。隔离和生长这些祖细胞或干细胞在体外的能力允许其扩张和打开大门，大量的实验不能达到体内，如H潜在的干细胞调控因子的IGH吞吐量测试。在这里，我们描述并演示从小鼠切牙的唇CL可靠和一致的方法来培养细胞。

Introduction

之一的脊椎动物的独特特征是牙齿的演化。牙齿已成为许多研究领域一个重要的模型系统，作为分子途径和相关与这个器官形态特化进行了研究从几个方面，包括发展和进化生物学家^5。最近，再生医学领域已经开始使用牙作为一种模式来获得有价值的见解。尤其，牙科上皮干细胞的发现是一个重要的进步^6-13。

所有啮齿类动物具有不断增长的门牙，其增长是得益于干细胞，使这些牙齿可访问的模型系统来研究成体干细胞的调控。标记实验在20世纪70年代^10,11，接着遗传谱系追踪实验^8,9,12,14，已经证明，DESCs驻留在门牙的近侧区域。干细胞的后代在唇侧移动了公认的小生，被称为唇颈环（CL）的上皮车厢，并有助于细胞称为运输扩增（TA）细胞（ 图1）的人口。具体来说，DESCs驻留在外部釉上皮（OEE）和星状网^{（SR）8,9,14，}和内釉上皮细胞（IEE）产生了对TA的细胞通过细胞周期的数量有限的进步，然后移动远侧沿着门齿的长度（ 图1）。在小鼠中切牙成釉细胞分化继续向远侧移动沿切牙以约350微米^15,16一天一个惊人的速度。因为他们移动，细胞分化为成熟的成釉细胞和中间层（SI）的细胞。沉积釉质基质的整个厚度后，许多成釉细胞发生凋亡，而其余的细胞收缩的尺寸和调节搪瓷成熟<燮> 17。在唇侧发光，如SR，其他类型的细胞谱系是不太清楚，并就干细胞在间充质¹⁸和舌CL数据才刚刚开始出现。

使用鼠标切牙模型，一些团体一直在努力阐明遗传途径和参与自然干细胞为基础的器官重建细胞生物学过程。但是，阴唇CL包含相对少量的细胞，估计为约5000每只小鼠切牙，这使得与原代细胞具有挑战性的工作。因此，已作出努力，以文化，以打开新的大门，以实验方法是无法达到在体内扩大这些细胞在体外 ^{6,16,19,20。}最近的研究表明，这些细胞可以既自我更新和分化成釉原蛋白表达细胞的培养时^，13。在这里，我们描述和展示为次的方法E可靠和一致的从鼠标唇发光细胞的培养。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1，解剖下半侧下颌骨从成年小鼠

在此之前执行此协议，获得必要的机构批准，并一定要遵守所有的动物护理指南。使用标准IACUC批准程序安乐死的动物。对这项工作的CO ₂窒息用于颈椎脱位。
1. 可选：使用剃刀刀片的身体的其余部分分离头。
从下唇除去皮肤的领口。
使用手术刀，使两个下门牙，它们松散地连接之间的切口。当施加压力时，下颌骨将被分成两部分。
楔颌骨髁突和颞下颌关节和削减沿着下颚肌肉之间的手术刀分离的下巴。
卸下所有肌肉，肌腱，韧带和直到只剩骨头仍然存在。

2，隔离切牙

使用＃15手术刀仔细刮掉骨以45°角从前端向膜区域的近端。使用手术刀的尖端挑走任何剩余的骨头，包括骨头碎片的边缘。慢慢开始随到随走在颌骨舌侧骨皮质，开始只是下面的^第三磨牙。
继续下去，直到切牙是干净的，精心赶制含CL的区域。
卸下下牙槽神经束。
做一个干净的切割，以先移除骨组织近端到CL。
做第二切口远端用手术刀，大致低于^第二磨牙。近端门齿区域，然后解剖出通过插入骨和近侧门牙的内侧表面之间的手术刀。这必须谨慎进行，以免撕裂组织。切口运动是近 - 远。
可供选择的步骤：
删除尽可能多的骨尽可能沿着我上方的区域ncisor。一旦区域被清除，使用5号镊子处理釉质部最靠近发光区域小心地取出整牙。
放置切取的组织（无论是分离的发光如在图3E中 ，或整个门齿作为替代步骤2.5）中在1X PBS 2％胶原酶为3-4小时，在4℃下在具有低粘附板。为1-10门齿，用每孔100μl的12孔板中。对于大于10门齿，用每孔500μl的在6 - 孔低粘附板。

3，Microdissect的唇颈环

从胶原酶和地方在寒冷的DMEM/F12培养基取出发光区域。
无论使用5号镊子或胰岛素注射器（1毫升，28 G½）在CL下端轻轻一拉;间质会土崩瓦解，而上皮细胞保持完整。 CL和相邻上皮细胞的横向为“翼状”结构延伸将是可见的。
清除从相邻的上皮通过使两侧的V形切口，并立即在冷的DMEM/F12放置在冰上的顶芽。
重复所有CLS，收集1.5 ml离心管中。
降速离心管样品，取出介质，替换为100微升细胞脱落的解决方案。
在孵育30分钟，细胞脱离组织液在37°C
离解的组织通过使用1,000微升低粘性枪头轻轻地上下吹打来产生单细胞悬浮液。细胞也可以通过无菌细胞过滤器放置来实现解离。
计数细胞，血球，板对组织培养塑料或其他所需材料。

DESCs 4。原代培养

板的细胞在6孔板中以1-6×10 ⁴个细胞/ ml的降序媒体，它由DMEM/F12补充有小鼠表皮生长因子的重组蛋白在20 n的浓度克/毫升，在浓度为25 ng / ml和1×B27添加剂和1％抗生素溶液（青霉素，100 U / ml的链霉素，50微克/毫升）的FGF重组蛋白质。
在5％CO ₂的1毫升降序媒体的生长细胞接种在6孔板中，在37℃。电镀，使细胞粘附和集落形成后请勿打扰初步培养5天。
对于第一媒体的变化，随着新媒体的一半体积（500微升）取代一半旧媒体的体积（500微升）的。检查菌落显微镜下变化的媒体的时候。
第一媒体的变化后，继续改变介质（1-2毫升），每2天。检查菌落显微镜下变化的媒体的时候。

5。通道DESCs

吸媒体和洗涤细胞3倍预热的PBS中。
添加预热的0.25％胰蛋白酶-EDTA在盐溶液中，并在37℃下进行10-15分钟的DESCs分离。
添加DESC媒体中和胰蛋白酶，轻轻地沿着组织培养板中吸取收集细胞，并将其放置在一个15毫升的锥形管。
降速细胞在800×g离心2分钟。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

鼠标半侧下颌骨包含一个不断增长的门牙三根臼齿（ 图1A）。所有的牙齿由牙本质和牙釉质，牙冠的两个矿化成分（ 图1A和1A'）的。门齿装有两个干细胞小生境称为CL唇和舌CL和搪瓷是在唇侧（ 图1A'）完全形成。 DESCs负责门齿釉质形成与被容纳在阴唇CL，特别是OEE和SR（ 图^1A'）8,9。唇CL也包含独立外部评价，TA细胞，和SI（ 图1A'）。我们的技术集中于阴唇CL（ 图1A'）的DESCs的解剖和隔离。KRT14-肌动蛋白的GFP标记半侧下颌骨（ 图1B）的所有上皮来源的细胞，和阴唇CL可以清楚地看到救援人员到场唉下颌骨（ 图1B'，白色箭头）。但应注意的是所有类型的细胞可在更高的放大倍率确定（比较图1A''和B'）。

从阴唇CL DESCs的隔离的步骤总结于图2。简言之，半侧颌骨首先从动物中取出，下颚骨被移除以暴露阴唇CL，然后阴唇CL被用胶原酶处理，以从周围的间质分开的上皮。该CL是显微切割，用细胞解离缓冲液处理，并接种于组织培养板中。分离阴唇的CL从底层颚骨（ 图3）和另外的介质适当体积是必不可少的分离和菌落的生长，分别。形成使用这种技术的小，紧上皮殖民地是由7天（ 图4A）可见，而这些成长为大菌落2-3周（ 图4B）内。

图1。成年小鼠切牙的插图（A）的成年小鼠半侧下颌骨显示矿化成分，牙釉质和牙本质，而这两种类型的牙齿，磨牙和切牙。近端切牙区，其中DESCs被安置在一个被突出显示“（A'）的近端切牙显示2干细胞小生境的矢状面来看，唇和舌颈环（LACL和LiCl），产生搪瓷釉细胞，并形成牙本质的牙本质。该LACL，这完全会产生成釉细胞祖细胞，并最终形成牙牙釉质是一个突出''（A''）的LACL显示外釉上皮（OEE），星状网（SR），内釉上皮细胞（IEE），过境放大（TA）的区域，而中间层（SI）。在SR上表示它的蓝色和深粉红色，以反映不同的密度的亚群。用荧光报道小鼠，KRT14-EGFP/Actb颈环（B）的可视化。骨是相对自身荧光，并除去骨的暴露颈环（B'）和上皮细胞，然后可以很容易地切下的其余部分（B'）的颈环的所有结构，包括OEE，IEE，TA和SI可以很容易地可视化与报告基因。比例尺B'，B“= 2毫米，B”= 50微米。请点击这里查看这个数字的放大版本。

es/ftp_upload/51266/51266fig2highres.jpg“宽度=”500“/>
图2。概述鼠标切牙的程序。示意图的CL的解剖和隔离 。该CL位于下颌门齿的近端。第一步是除去周围的颚骨露出门牙与CL完好。接着，对牙齿器官被隔离并置于2％胶原酶从间充质上皮分离。后4小时温育后，CL被手动切除，解离成单细胞，而顶上标准组织培养板中培养。

图3。骨切除下颌骨鼠标，露出底层的发光区域。视觉检查点的骨切除术过程如图（a）所示半侧下颌骨一折后步骤1.5中，一旦肌肉，腱和韧带从骨除去（B）表示的区域，开始除去骨，从正下方的^第三磨牙开始，向近侧朝着含有CL的区域。接着，所有骨近端到CL除去（C），如在步骤2.4说明。接下来的切口，如步骤2.5所述以去除骨的其余部分示于（D）。最后，CL是从如步骤2.6（e）项，其余骨取出，放大显示（插图）。

图4。成功克隆形成体外的代表性结果。DESCs的A.相衬显微术，镀在培养7天之后。紧集落形成表示成功上皮isolatioÑ没有骨髓间充质污染。比例尺= 400微米。B.经过10天的潜伏期，菌落面积较大和细胞具有典型的上皮细胞形态的鹅卵石。比例尺= 100微米。请点击此处查看该图的放大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

上皮细胞首次成功培养了40年前^21-24，以及最近的上皮干细胞^25-27成功分离了我们先进的上皮生物学知识。我们报告一个协议，用于分离成年小鼠切牙的DESCs，干细胞的相对充分研究人口，有产生了重要的见解牙科生物学和牙釉质形成的可能性。该协议最初是基于对上皮干细胞的分离从毛囊²⁸以前的报告。而许多协议使用饲养层和血清维持上皮干细胞，我们的方法是一项联接免费，无血清体系。然而，我们的成长介质则需要使用EGF，FGF2和B27添加剂的鸡尾酒。 EGF长期以来被用于维持未分化的细胞^29。 EGF和FGF2连同B27鸡尾酒以前用来培养毛囊干细胞²⁷和B27被广泛地用于维持神经干细胞在培养^30,31。我们还预先测定DESCs顶上组织培养塑料和对各种细胞外基质底物的活力和生长速率的特点，并且在扩散¹⁹的速率没有检测到差异。可以保持多达10个连续传代的细胞^19。

我们使用，因为易于除去相比，上门牙的用于此过程中的下门牙。隔离期间，我们的协议中最重要的步骤是将胶原酶和CL的清洁显微切割前彻底清除发光面积从下颌骨。因为近端切牙是非常微妙的，它剥离时不要损坏它，这可能会导致唇CL的损失是很重要的。完全去除会导致labialCL的残余和DESCs的产量较低。此外，它以避免污染与非C是重要L上皮细胞。因此，在上皮细胞已被分离的间充质，干净的V形切口应作出从邻近的上皮去除阴唇CL。最后，它是必不可少的板，这些细胞在用1×10 ⁴个细胞每毫升的浓度和离开一半的条件培养基用于第一介质的变化。

此协议牙科研究的主要好处是它允许高效率的生产和处理体外 DESCs的，虽然鼠标门牙被确立为体内模型^{7-9,12,32-34，} 在体外系统的开发打开大门，实验难以在体内进行推进牙科研究领域。此系统的优点包括能够容易地操纵细胞在不同培养条件下，单个甚至多个信号通路容易定位的能力，以及抑制TA的或活化利用siRNA或生长因子rgeted分子。该体外系统的下游应用，包括使用上面列出的技术，以及其它切削刃的技术来进行功能性和/或机械的研究，特别是在单细胞水平。

总体而言，从DESC 体外培养收集的信息可以帮助解开干细胞为基础的牙齿重建的复杂性。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

该作者有没有利益冲突披露。

Acknowledgments

作者感谢王秀萍的初步帮助与DESC文化。提交人由来自美国国立卫生研究院（K99-DE022059到AHJ，K12-GM081266到MGC，K08-DE022377-02 OH和R01-DE021420到ODK）奖学金和助学金资助了一部分。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps, size 5	Fine Science Tools	11251-30	FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5	Roboz	RS5070
Razorblades	Electron Microscopy Services	#71960
Scalpel Handle No. 3	VWR
Feather Blade No. 15	Electron Microscopy Services	#72044-15	Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered	Worthington Biochemical Corporation	#4214
Insulin syringe	BD	#329424
Accumax	EMD Millipore	#SCR006
DMEM/F12	Gibco	11320-033
EGF	R&D	2028-EG-200
FGF2	R&D	233-FB-025
B27 Supplement	Gibco	10889-038