La impresión Sumergido de células sobre una superficie modificada utilizando un flujo continuo Microspotter

Resumen

Esta tecnología de impresión microfluídica 3D imprime matrices de células en superficies sumergidas. Describimos cómo las matrices de células se entregan microfluídicamente en celdas de flujo 3D sobre superficies sumergidas. Al imprimir en superficies sumergidas, se produjeron microarrays celulares que permiten el cribado de fármacos y la evaluación de la citotoxicidad en una multitud de áreas.

Resumen

La impresión de células para aplicaciones de microarrays presenta importantes desafíos, incluyendo el problema de mantener el fenotipo celular fisiológicamente relevante después de la impresión, una mala organización y distribución de las células deseadas, y la incapacidad de administrar fármacos y/o nutrientes a áreas específicas en el array. Nuestra tecnología de impresión microfluídica 3D es excepcionalmente capaz de sellar e imprimir matrices de celdas en superficies sumergidas de manera automatizada y multiplexada. El diseño de la fluidicidad 3D de la matriz de celdas microfluídicas (MFCA) permite que la punta del cabezal de impresión se baje a un pozo o plato lleno de líquido y se comprima contra una superficie para formar un sello. La punta de silicona suave del cabezal de impresión se comporta como una junta y es capaz de formar un sello reversible aplicando presión o retrocediendo. Otras tecnologías de impresión de células, como las impresoras de pin o de inyección de tinta, no pueden imprimir en aplicaciones sumergidas. La impresión en superficies sumergidas es esencial para mantener los fenotipos de las células y para monitorear estas células en una superficie sin alterar las características de la superficie del material. Al imprimir en superficies sumergidas, se producen micromatrices celulares que permiten el cribado de fármacos y la evaluación de la citotoxicidad en una multitud de áreas, como el cáncer, la diabetes, la inflamación, las infecciones y las enfermedades cardiovasculares.

Introducción

Los avances recientes en la industria farmacéutica han conducido a un mayor interés en el uso de microarrays de celulares en el proceso de descubrimiento de fármacos para la detección de drogas y análisis cytotoxicological ^1,2,3. El desarrollo de los ensayos in vitro de alto rendimiento y los métodos de detección utilizando microarrays de células facilitaría el desarrollo rápido y rentable de los candidatos de la droga, así como en el avance de la comprensión fundamental de la célula de ^1,4. El enfoque tradicional para el cribado con células utiliza plataformas de placa de pocillos convencionales; Sin embargo este enfoque es limitado debido al alto costo, rendimiento limitado, y la capacidad limitada para obtener información cuantitativa sobre la función celular ^1,5. Debido a estas limitaciones, la investigación en las tecnologías de microarrays celular está creciendo para la caracterización molecular biológica, la ingeniería de tejidos, y la detección de drogas ^1,6. Las ventajas de los microarrays de celulares incluyen el uso de la muestra más pequeña, efectos mínimos deheterogeneidad fenotipo celular enmascarar la información, y lo más importante la capacidad de automatizar los ensayos para más aplicaciones de alto rendimiento ^1,7,8.

La industria farmacéutica utiliza actualmente ensayos de cribado basados ​​en células de alto rendimiento con cultivos monocapa de células 2D para la detección de drogas en placas de pocillos de microtitulación ^9. Células de multiplexación en pocillos de placas de microtitulación ofrece el potencial para un mayor rendimiento con opciones de experimentación únicas. Además, las tecnologías actuales para microarrays de celulares permiten que las células se sequen que podría alterar dramáticamente el fenotipo de las células in vivo a partir de ^10,11. Con el fin de superar estos problemas, el ACFM se ha diseñado y se muestra en la Figura 1. El diseño de los fluidos MFCA 3D permite a la punta del cabezal de impresión en la Figura 1 para ser rebajado en un baño y se comprime contra una superficie para formar un sello. La punta de silicona suave de la cabeza de impresión se comporta como unjunta y forma un sello reversible. La tecnología ACFM es adecuado de forma única para interactuar con las superficies sumergidas, que se requiere para ambos cultivos celulares y sistemas de corte de tejido, y es difícil o imposible con la mayoría de otros enfoques. Alfileres o impresión por chorro de tinta no va a funcionar, y los dispositivos de microfluidos en 2D no son adecuados para la deposición o la interconexión con grandes conjuntos de puntos discretos. Además, por la miniaturización y la localización de la experimento - el microarray celular - la ACFM supera los principales problemas asociados con ensayos de cribado basados ​​en células de alto rendimiento.

El CFM utiliza redes de canal 3D para pequeñas muestras de fluido de volumen de ciclo más de los lugares críticos microscópicos en una superficie de ^12,13. Al imprimir con flujo, biomoléculas, células, y otros reactivos se mantienen en un medio líquido durante todo el proceso de impresión, lo que permite la impresión de biomoléculas y células sensibles y sin exposición al aire, lo que dificulta las técnicas de impresión celda actual. También es posible imprimir directamente de material en bruto como hibridoma o sobrenadantes cumpliendo con un mecanismo de captura sobre la superficie de la matriz. El objetivo de este manuscrito es explicar en detalle la impresión sumergida de dos tipos de células sobre una superficie.

Protocolo

1. Preparación de células Cultura

1. Almacene las poblaciones de células NIH/3T3 en nitrógeno líquido hasta que esté listo para su uso.
2. Preparar los medios de comunicación completa para células NIH/3T3 utilizando medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%, tampón HEPES 10 mM, 50 unidades / ml de penicilina, y 50 mg / ml de estreptomicina.
3. Descongelar las células durante 2-3 minutos en un baño de agua con agitación a 37 ° C.
4. Resuspender las células en 5 ml de medio completo y se centrifuga a 1500 xg durante 3 min.
5. Eliminar el sobrenadante de células sin alterar el sedimento celular.
6. Resuspender las células en 5 ml de los medios de comunicación y contar las células usando un hemocitómetro.
   1. Retire 10 l de la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
   2. Añadir 10 l de azul de tripano a la suspensión celular y se agita con la punta de la pipeta.
   3. Pipetear 10 l de las células teñidas en una cámara de hemocitómetro.
   4. Contar las células en un hemocitómetro a 10xmagnificación.
      1. Contar las células vivas (pequeñas bolas blancas) para 4 de los 9 cuadrados grandes. Sólo contar las células vivas que no aparecen de color azul oscuro de la mancha azul de tripano.
      2. Calcular el número medio de células por cuadrado grande, lo que resulta en el número de células x 10 ⁴ células / ml en la suspensión original de células.
      3. Se siembran las células a una densidad de 1 x 10 ⁵ células / ml con un total de 5 ml en cada matraz T25.
   5. Cultivar las células a entre 70% y 80% de confluencia antes de los experimentos iniciales. Actualizar medios cada 2-3 días o cuando sea necesario.

2. Preparación de la superficie de impresión

1. Marcar un rectángulo con el marcador en la parte inferior de una cultura-tratada de tejido de poliestireno (TCTPS) 12 placa así el tamaño de la cabeza de impresión (7 mm x 19 mm).
2. Añadir 50 l de suero fetal bovino en el área rectangular y se extendió por toda la región, con la punta.
3. Deje la placa de Petrien una estéril bioseguridad capó O / N para que el lugar de suero se seque por completo. Estas placas deben estar preparados no más de 2 días antes de su uso.

3. Impresión Sumergido

1. Enjuague el cabezal de impresión con agua destilada.
   1. Llene un 60 mm placa de Petri con agua destilada y acoplar el cabezal de impresión en la superficie.
   2. El flujo de agua destilada a través de cada una de las líneas durante 2 minutos a 150 l / min utilizando una bomba neumática.
   3. Deseche el agua de la placa de Petri y llenarlo con agua limpia.
   4. Mueva el cabezal de impresión hacia arriba y hacia abajo en el agua 3 veces.
2. Acople el centro de la cabeza de impresión sobre el lugar de suero recubierto en la placa de pre-preparado 12.
3. Cebe el cabezal de impresión con medios completos pre-calentado, 300 l por canal.
4. Imprimir células suspendidas a una concentración de 50.000 células / ml sobre la superficie y 60 l / min, 100 l por canal.
5. Coloque el cabezal de impresión, izquierdo atracado en contra de lasuperficie, y el colector en una incubadora de cultivo celular establece en 5% de CO ₂ y 37 ° C durante 2 h.
6. Después de la incubación de 2 horas, retire el cabezal de impresión y coloque la tapa en la placa de cultivo. El momento en el que el cabezal de impresión elimina se considera el punto de tiempo 0 h.

4. Cultivo Celular Estándar

1. Añadir 1 ml de medio de pre-calentado a una de la placa TCTPS 12 pocillos sin suero manchado preparado en el paso 2.
2. Tomar 1 ml de la suspensión celular restante de la etapa 2 y la pipeta en un solo pocillo de una TCTPS placa de 12 pocillos. Esto producirá un cultivo que contiene 50.000 células en el plato.
3. Coloque la placa de cultivo de células en una incubadora a 37 ° C durante 2 h.
4. Después de la incubación de 2 horas comenzar el tiempo; para mantener la coherencia entre las muestras impresas y de siembra, esto se considera el punto de tiempo 0 h.

5. Visualización Cultura

1. Después de 0, 2, 24, y 48 células toman horas de cada uno de los dos métodos described arriba y la imagen usando un microscopio invertido estándar.
   1. Teñir las células con yoduro de propidio, una mancha fluorescente de color rojo que sólo se incorpora en el núcleo de las células muertas.
      1. Enjuague suavemente las células 3 veces con 1 ml de PBS con calcio y magnesio (PBS + +) para eliminar los residuos.
      2. Añadir 1 ml de pre-calentado PBS + + para cada recipiente de cultivo.
      3. Añadir 1 l de solución de yoduro de propidio de stock (1 mg / ml) a cada recipiente de cultivo.
      4. Se incuban las células teñidas con yoduro de propidio a 37 ° C durante 10 min.
   2. Imagen de las células utilizando un microscopio invertido a 10x y 40x.
2. Deseche las células en un contenedor de residuos sanitarios apropiados.

Resultados

Las células NIH/3T3 línea celular de fibroblastos se imprimieron o sembradas en una superficie sumergida. Las células fueron cultivadas a una densidad de 5 X 10 ⁴ células por ml. Se sembraron las células usando técnicas de cultivo celular tradicionales. Las células se imprimieron utilizando un gran formato, cabezal de impresión de células de doce flujo donde los canales son más grandes (~ 500 micras) que el CFM utilizado para las proteínas y otras biomoléculas. Las células se sembraron impresos o sobre una su...

Discusión

La tecnología de impresión 3D de microfluidos se describe aquí es el único capaz de microfluidically matrices de impresión de las células en un líquido lleno de bien, es decir, una superficie sumergida. Por la impresión sobre superficies sumergidas, de células microarrays se pueden producir que mantienen el fenotipo celular fisiológicamente relevante de las células, así como la capacidad de multiplexar las células en el fondo de un solo pozo Figura 4. Los resultados de este estudio muestran que...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microobservador de flujo continuo	Wasatch Microfluidics
Células NIH/3T3	ATCC	CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	Medios base para células
Tampón HEPES	Invitrogen	15630-080	Aditivo de medios celulares (pH de control)
Piruvato de sodio	Invitrogen	11360-070	Aditivo de medios celulares
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen		Aditivo para medios celulares
Azul de tripán	Invitrogen	15250-061	Tinción de células spara recuento
Hemocitómetro	Fisher	267110	Cámara de células para contar células
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Se utiliza para comprobar las células
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Se utiliza para recopilar imágenes
Solución salina tamponada con fosfato (con calcio y magnesio)	Invitrogen	14040-133	Enjuague de las células antes del paso y antes de la tinción con PI
TrypLE Express	Invitrogen	A12177-01	Se utiliza para eliminar células de la superficie