Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Resumen

En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo in vitro utilizando Estructurado Iluminación Microscopía (SIM). Super-resolución de la microscopía utilizando SIM ofrece una resolución de imagen de manera significativa más allá del límite de difracción de la luz en las tres dimensiones espaciales, lo que permite la obtención de imágenes de las espinas dendríticas individuales con detalles mejorados.

Resumen

Las espinas dendríticas son protuberancias que salen de la dendrita de una neurona y representan los objetivos primarios postsinápticos excitatorios de entradas en el cerebro. Los avances tecnológicos han identificado estas estructuras como elementos clave de la conectividad neuronal y la plasticidad sináptica. El análisis cuantitativo de la morfología de la columna vertebral utilizando microscopía de luz sigue siendo un problema esencial debido a las limitaciones técnicas asociadas con límite de refracción intrínseca de la luz. Las espinas dendríticas pueden identificarse fácilmente por confocal de escaneo láser microscopía de fluorescencia. Sin embargo, la medición de los cambios sutiles en la forma y tamaño de las espinas es difícil debido a las dimensiones de la columna vertebral que no sean de longitud son generalmente más pequeñas que la resolución óptica convencional fijada por resolución límite teórico de la microscopía de luz de 200 nm.

Varias técnicas de resolución de súper desarrollados recientemente se han utilizado para imagen estructuras celulares más pequeños que los 200 nm, incluyendo las espinas dendríticas. Tstos técnicas se basan en operaciones de campo lejano clásicos y por lo tanto permiten el uso de los métodos existentes de preparación de muestras y para la imagen más allá de la superficie de una muestra. Descrito aquí es un protocolo de trabajo para aplicar la resolución estructurada de iluminación microscopía super (SIM) para la obtención de imágenes de las espinas dendríticas en cultivos de neuronas del hipocampo primaria. Posibles aplicaciones de SIM se solapan con las de microscopía confocal. Sin embargo, las dos técnicas presentan diferente aplicabilidad. SIM ofrece una resolución lateral efectiva más alta, mientras que la microscopía confocal, debido al uso de un agujero de alfiler física, logra una mejora de resolución a costa de la eliminación de fuera de la luz de enfoque. En este protocolo, las neuronas primarias se cultivan en cubreobjetos de vidrio utilizando un protocolo estándar, transfectadas con plásmidos de ADN que codifican proteínas fluorescentes y fotografiado usando SIM. Todo el protocolo descrito en el presente documento toma aproximadamente 2 semanas, porque las espinas dendríticas son imágenes después de 16-17 días in vitro, cuandodesarrollo dendrítico es óptima. Después de completar el protocolo, las espinas dendríticas pueden ser reconstruidos en 3D de la serie de SIM pilas de imágenes utilizando el software especializado.

Introducción

Una espina dendrítica es una pequeña protuberancia de la membrana de la neurona. Esta estructura característica está especializada para recibir normalmente el aporte de una sola sinapsis y representa el área de contacto físico entre dos neuronas. La mayoría de las espinas dendríticas funcionalmente maduros consisten en una punta globular, jefe llamado, y un cuello delgado que conecta la cabeza con el árbol dendrítico. Sin embargo, las espinas no son estáticos y se mueven y cambian su morfología continuamente, incluso en el cerebro adulto ² activa. Dentro de un período de 2 semanas de tiempo, cultivos de neuronas del hipocampo de rata primaria derivados de ....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con animales han sido optimizados para reducir el sufrimiento de los animales y fueron aprobados por la Comisión de Experimentación Animal de la Universidad de Amsterdam, diciembre protocolo # DED204 y DED250.

1. Preparación Cubreobjetos

1. Reduzca los cubreobjetos a un tamaño de 15 mm x 15 mm con un carburo o escribano diamante, para que quepan en los pocillos de una placa de 12 pocillos.
2. Mientras trabajaba en una campana extractora, inicie recubrimiento cubreobjetos sumergiendo totalmente cubreobjetos en solución de ácido nítrico concentrado (70% peso / peso) en un recipiente de ....

Resultados

Descrito aquí es un protocolo de trabajo estandarizado para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria in vitro utilizando SIM. El flujo de trabajo de protocolo y sus pasos cruciales se muestran en la Figura 1. En general, el protocolo de toma aproximadamente 2 semanas de trabajo experimental separados en una primera fase de preparación de la muestra, incluyendo la cultura, el desarrollo y la transfección de las neuronas del hipocampo de rata prim.......

Discusión

En este artículo se describe un protocolo de trabajo para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata en cultivo primario in vitro utilizando SIM. El método de cultivo de neuronas del hipocampo primaria es una adaptación del método original descrito por Banker Kaech y ^18. Las diferencias principales son el uso de medio Neurobasal/B27 cultura, lo que elimina el requisito de las culturas de alimentación astroglial, y la adición de la FUDR inhibidor mitótico en el d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas
Pinzas
Tijera
grande
Espátula roma
Microscopio de disección con iluminación
Microscopio
37 & Grados; C Baño
			cultivo celular de flujo laminar
Horno
Quemador
Incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 & deg; C)
Microcentrífuga
Agitador
[header]
Configuración del microscopio de iluminación estructurada de Nikon que consta de:
Microscopio invertido de investigación Nikon Eclipse Ti con sistema
Nikon CFI Apo TIRF 100x lente de objetivo de aceite (N.A. 1.49)
4 Láseres de zafiro coherentes (longitud de onda de salida de 458, 488, 514 y 561 nm)
Iluminador
Controlador de escenario Nikon Controlador
piezoeléctrico MCL Nano-Drive Lámpara
			mercurio Nikon Intensilight C-HGFIE
Microscopio SIM Control de temperatura
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC con Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon' s Paquete de software NiS Elements 6.14 SIM Aceite
			de inmersión Nikon tipo A