Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Resumen

Aquí se describe un flujo de trabajo para el análisis rápido y colecciones de imágenes de microscopía de fluorescencia utilizando PhenoRipper, una plataforma de análisis de imagen recientemente desarrollado explorar.

Resumen

A pesar de los rápidos avances en microscopía de alto rendimiento, los ensayos basados ​​en imágenes cuantitativos siguen planteando retos importantes. Aunque una variedad de herramientas especializadas de análisis de imagen están disponibles, la mayoría de los flujos de trabajo basados ​​en análisis de imágenes tradicionales tienen empinadas curvas de aprendizaje (para el ajuste fino de los parámetros de análisis) y dan lugar a tiempos de respuesta largos entre las imágenes y el análisis. En particular, la segmentación de células, el proceso de identificación de células individuales de una imagen, es un cuello de botella importante en este sentido.

Aquí presentamos un suplente,-segmentación libre de células de flujo de trabajo basado en PhenoRipper, una plataforma de software de código abierto diseñado para el rápido análisis y exploración de imágenes de microscopía. El oleoducto que aquí se presenta está optimizado para imágenes de microscopía de inmunofluorescencia de cultivos celulares y requiere mínima intervención del usuario. Al cabo de media hora, PhenoRipper puede analizar los datos de un experimento típico de 96 pocillos y generar perfiles de imagen. Los usuarios puedenluego explorar visualmente sus datos, lleve a cabo el control de calidad en su experimento, garantizar una respuesta a las perturbaciones y comprobar la reproducibilidad de repeticiones. Esto facilita un ciclo de retroalimentación rápida entre el análisis y la experimentación, que es crucial durante la optimización de ensayo. Este protocolo es útil no sólo como un análisis de primer paso para el control de la calidad, pero también puede ser utilizado como una solución de extremo a extremo, especialmente para el cribado. El flujo de trabajo descrito aquí se escala para grandes conjuntos de datos, tales como los generados por las pantallas de alto rendimiento, y se ha demostrado al grupo de condiciones experimentales por fenotipo con precisión en una amplia gama de sistemas biológicos. La interfaz PhenoBrowser proporciona un marco intuitiva de explorar el espacio fenotípico y relacionar propiedades de imagen en las anotaciones biológicas. En conjunto, el protocolo descrito aquí bajará las barreras para la adopción de un análisis cuantitativo de las pantallas de imagen basados.

Introducción

Durante la última década, los rápidos avances en la tecnología de imágenes han dado muchos laboratorios la capacidad de realizar la microscopía de alto rendimiento. Ahora, el reto se ha desplazado de una de las imágenes a una de análisis. ¿Cómo podemos caracterizar, comparar y explorar el torrente de complejos fenotipos aún sutiles generadas por una típica pantalla de proyección de imagen de alto rendimiento?

Una serie de análisis de imagen e informática plataformas han dado los usuarios cajas de herramientas sofisticadas ^1-3 para la extracción de información biológica de las grandes colecciones de imágenes. Sin embargo, muchos....

Protocolo

1. Muestras Preparación y Imaging

1. Cultivo celular
   1. Dividir culturas rutinaria y mantener al 20-70% de confluencia. Un día antes del experimento, crecer células HeLa en DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco, véase la Tabla de Materiales) y suplementado con 10% de FBS (suero bovino fetal) y 1x penicilina / estreptomicina.
   2. En el día de experimento, las células de división cada vez mayor en la cultura (alrededor del 50% de confluencia).
   3. Lavar las células con PBS (tampón fosfato salino), exponerlo a aproximadamente 2 ml de tripsina / EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) durante unos segundos. Aspirar el exceso de tripsina / EDTA....

Resultados

Aquí hemos probado la capacidad de este flujo de trabajo para los medicamentos del grupo en función de su mecanismo de acción. Células HeLa fueron sembradas en 30 pocillos de una placa de 384 pocillos y se tiñeron para ADN / actina / α-tubulina. Los anticuerpos específicos primarios, anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, y otras manchas fluorescentes que fueron utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales. Wells fueron tratados con 15 medicamentos que pertenecen a tres clases mecanicistas (inhibición d.......

Discusión

El flujo de trabajo aquí descrito permite la caracterización y comparación de imágenes de microscopía fácil y rápido. En primer lugar, demostramos cómo este flujo de trabajo puede ayudar a la optimización de experimento, por ejemplo mediante la realización de controles de calidad de forma rápida en las imágenes de microscopía. A continuación, se demostró su potencial para el análisis de los datos de detección de alto rendimiento: hemos sido capaces de drogas del grupo en función de su mecanismo de acción. La agrupación .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM, Alto contenido de glucosa	Invitrogen	11965	de L-glutamina
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Tinción de ADN, dilución 1:2.000 de 5 mg/ml de caldo de 5 mg/ml
Marcador faloidina-Alexa Fluor 488	Invitrogen	A12379	Falotoxina conjugada, dilución 1:200
Anticuerpo primario &alfa;-tubulina	Sigma	T9026	Primario Ab, ratón monoclonal, dilución 1:200
Secundario Antivody anti-Ratón TRITC	Jackson	115-025-166	Ab secundario conjugado, 0,5 mg en 1 ml PBS + 1 ml glicerol
Concentración de aldosterona			utilizada: 0,2 μ M
Concentración de apicidina			utilizada: 20 μ M Concentración
colchicina			utilizada: 0,16 μ M Concentración
cortisol			utilizada: 0,2 μ M
Concentración de dexametasona			utilizada: 0,2 μ Concentración de
docetaxel			M utilizada: 0,2 μ M
M344			concentración utilizada: 20 μ M
MS-275			concentración utilizada: 5 μ M Concentración
nocodazol			utilizada: 0,3 μ M Concentración
prednisolona			utilizada: 0,2 μ M
RU486			concentración utilizada: 0,2 μ M
Concentración de Scriptaid			utilizada: 70 μ M
Concentración de taxol			utilizada: 0,3 μ M
Concentración de tricomatina A			utilizada: 0,2 μ M
Concentración de vinorelbina			utilizada: 0,3 μ M

Alto contenido de glucosa, marcador dededede