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Artículo de método

Ensayo Proteasomal degradación en un sistema libre de células en las plantas

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DOI:

10.3791/51293

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26 de marzo de 2014

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1Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University, State University of New York

En este artículo

Resumen

Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven "etiquetas" como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas.

Resumen

La vía de la ubiquitina-proteasoma para la degradación de proteínas se ha convertido en uno de los mecanismos más importantes para la regulación de una amplia gama de funciones celulares en prácticamente todos los organismos eucariotas. Específicamente, en las plantas, el sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS) regula la degradación de proteínas y contribuye significativamente al desarrollo de una amplia gama de procesos, incluyendo la respuesta inmune, desarrollo y muerte celular programada. Por otra parte, cada vez más evidencia sugiere que numerosos patógenos de las plantas, tales como Agrobacterium, explotan la acogida de UPS para la infección eficiente, haciendo hincapié en la importancia de la UPS en las interacciones planta-patógeno.

La especificidad de sustrato de la UPS se consigue mediante la ubiquitina ligasa E3 que actúa en concierto con la E1 y E2 ligasas para reconocer y marcar moléculas de proteínas específicas destinadas a la degradación por unir a ellos cadenas de moléculas de ubiquitina. Una clase de las ligasas E3 es el SCF (Skp1 / Cproteína ullin / F-box) compleja, que reconoce específicamente los sustratos de UPS y los dirige a través de su componente de ubiquitinación de proteínas F-box. Para investigar un posible papel de la UPS en un proceso biológico de interés, es importante para idear un ensayo simple y fiable para la degradación de proteínas mediada por UPS. Aquí, se describe uno de tales ensayo utilizando un sistema libre de células de la planta. Este ensayo se puede adaptar para el estudio de las funciones de la degradación de proteínas regulado en diversos procesos celulares, con un enfoque especial en los F-box interacciones proteína-sustrato.

Introducción

La vía del proteasoma ubiquitin/26S está emergiendo como un mecanismo generalizado para el control de diversas reacciones biológicas, incluyendo la regulación transcripcional, la progresión del ciclo celular y la transducción de la señal, el receptor de baja regulación o endocitosis, entre otros procesos de 1-4. En esta vía, la proteína diana se marca por ubiquitina residuos que se unen primero a través de un enlace tioléster de enzima ubiquitina-activación de E1 y luego trasladadas a un residuo de aminoácido cisteína de la enzima ubiquitina-conjugación E2; finalmente, E2 interactúa con ubiquitina ligasa E3 , lo que resulta en polyubiquitination del sustrato proteína. En última instancia, las proteínas polyubiquitinated son reconocidos y degradados por el proteasoma 26S. En este mecanismo, la enzima E3 especifica el sustrato y actúa como el componente regulador clave del sistema de proteasoma ubiquitin/26S (UPS). Ligasas E3 pueden actuar independientemente, tales como ligasas de dominio ANILLO, o como parte de un SCF de múltiples subunidades (Skp1/Cullin/F-box proteína) compleja, como ligasas de dominio F-box. Vías de degradación proteasomal mediadas por SCF están involucrados en la regulación de la transcripción, el ciclo celular, la transducción de señal de 5-10 y muchas otras funciones celulares importantes.

Además de estos papeles críticos en la regulación de procesos celulares, UPS toma el escenario central en muchas de las interacciones planta-patógeno. Por ejemplo, el aumento de la evidencia sugiere que varios patógenos de plantas, incluyendo Agrobacterium tumefaciens, se basan en la acogida de UPS para facilitar el proceso de infección 11. Agrobacterium provoca crecimientos neoplásicos en las plantas, que representan sus huéspedes naturales, y también puede transformar una amplia gama de otros eucariotas, a partir de hongos 1,2 a las células humanas 12,13. Durante su infección, de Agrobacterium exporta un elemento de ADN (ADN-T) y varios virulencia (Vir) las proteínas en la célula huésped 12-13. Una de estas proteínas es VirF, la primera proteína F-box encontradopara ser codificada por un genoma procariota 14. Como parte del complejo SCF ubiquitina ligasa, VirF, y su homólogo anfitrión funcional VBF 15, facilitar la infección de Agrobacterium a través de la degradación de proteínas mediada por la UPS, que presumiblemente facilita uncoating de la T-ADN bacteriano invasor de sus acompañan proteínas bacterianas y de acogida, VirE2 y VIP1, respectivamente 16,17. Curiosamente, muchas proteínas F-box, incluyendo VirF, son intrínsecamente inestables debido a su propia proteólisis, que está mediada por la actividad autoubiquitination 18,19 o por otras ligasas E3 para el que F-box proteínas pueden servir como sustratos 20-23.

Al estudiar las actividades bioquímicas de las proteínas F-box, otras ligasas de ubiquitina, y / o sus sustratos, sería muy útil emplear un ensayo sencillo y fiable para la degradación proteasomal. Aquí se describe un protocolo de este tipo para el análisis de estabilidad de la proteína en una célulaSin sistema. En este ensayo, la estabilidad del sustrato de UPS se analiza en la presencia o ausencia de uno de los componentes esenciales de la vía de degradación proteasomal, tales como una proteína de la caja F, en un sistema libre de células. En general, expresamos la proteína (s) ensayados en los tejidos vegetales, preparar los extractos libres de células de estos tejidos y controlar las cantidades de la proteína (s) de interés por el Western Blot. El mecanismo de la UPS dependientes de la degradación de proteínas se demostró mediante la inclusión de inhibidores de proteasomal específicos y / o el uso de co-expresión de la forma dominante negativa de un componente de SCF, Cullin. Considerando que ilustramos este ensayo usando la degradación proteasomal de la proteína de Arabidopsis VIP1 17 por la proteína F-box VBF 15, que se puede emplear para investigar la estabilidad de los otros sustratos proteasomal.

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Protocolo

1. La expresión de proteínas

  1. Elección del sistema de expresión
    Seleccione el sistema, es decir, los vectores y el método de entrega de vectores, el más adecuado para la expresión de la proteína de interés en el modelo de organismo / celda específica. Tenga en cuenta que nuestro ensayo requiere la expresión de las proteínas de la prueba en cantidades fácilmente detectables, lo que se consigue mejor mediante la transformación transitoria de un gran número de células. En las plantas, por ejemplo, esto se realiza mejor usando plásmidos binarios como vectores de expresión y de Agrobacterium como sistema de entrega.
  2. Construcción de vectores de expresión binarios
    Clonar la secuencia codificante (s) de la proteína (s) de interés en un vector de expresión, ya sea solo o en fusión traduccional a una etiqueta de epítopo. Uso vectores adecuados para el sistema de expresión elegido y procedimientos estándar de biología molecular para la clonación de genes. Para la entrega de genes mediada por Agrobacterium, emplear vectores binarios y introducirlos, también utilizando Standaprotocolos Rd, en una cepa de Agrobacterium, tales como EHA105, para la posterior inoculación de tejidos de plantas.
  3. Elección de las especies de plantas
    Seleccionar las especies de plantas en el que se expresa la proteína (s) de interés. Tenga en cuenta que, mientras que cualquiera de las especies de plantas susceptibles a la transformación genética mediada por Agrobacterium se pueden utilizar, nuestros especies de plantas de elección es Nicotiana benthamiana, que se cultiva fácilmente, altamente susceptibles a Agrobacterium, y tiene grandes hojas que se inoculan fácilmente.
  4. Crecimiento de las plantas
    Haga crecer una planta de 4 a 6 semanas en una olla con Pro-Mix BX en una olla (20 cm x 20 cm x 20 cm) en condiciones de ambiente controlado-(por ejemplo, la cámara de crecimiento) de día largo (es decir, 16 h de 130 -150 E · m-2 s-1 la luz a 23 º C y 8 ​​h oscuridad a 20 ° C) y una humedad relativa del 40-65%.
    1.5.2 Abono de vez en cuando con los productos disponibles en el mercado según las instrucciones del fabricante. Una vez que la planta se cultiva, seleccionehojas con el tamaño de 50 mm x 70 mm o mayor (estas mediciones de longitud no incluyen el pecíolo) para la inoculación de Agrobacterium.
  5. La inoculación con Agrobacterium
    Crecer la cepa de Agrobacterium que alberga la construcción binaria que expresa la proteína (s) de prueba de la etapa 1.3 durante la noche a 28 ° C en medio YEP (1% de peptona, extracto de levadura 1%, y 0,5% de NaCl) suplementado con los antibióticos apropiados (por ejemplo, 100 mg / l de estreptomicina y 10 mg / L de rifampicina para los vectores basados ​​en pPZP-RSC2 24-25).
    1.6.2 Centrifugar las células, se resuspendieron a OD 600 = 0,5 en tampón de infiltración [10 mM de MgCl 2, Mes 10 mM (pH 5,6), acetosiringona 100 mM], y se incuba durante 2 h a temperatura ambiente. Infíltrate en la cultura en la cara abaxial de una hoja, utilizando una jeringa sin aguja 1-ml; en cuenta que las hojas se inoculan in situ, mientras que está unido a la planta.
    1.6.3 Después de la infiltración, cultivar la planta durante 72 h bajo el régimen de luz de 16 h 130-150 y# 181; E m-2 s-1 la luz a 23 ° C / 8 h oscuridad a 20 ° C antes de la cosecha.
  6. La aplicación de inhibidores de proteasomal
    Para apoyar la idea de que la proteína (s) prueba es degradada por una vía proteasoma, usar inhibidores de proteasomal MG132 específicos y lactacistina 28-29, lo que debería reducir o incluso bloquear la degradación. Cuatro horas antes de la cosecha (ver Paso 2.1), infiltrarse en las áreas de la hoja inoculado con Agrobacterium con 10 M de MG132 (EMD Millipore) o 10 mM lactacistina (Sigma-Aldrich) o maqueta tratar la hoja con los respectivos disolventes, es decir, 0,1% de DMSO o agua destilada.

2. Preparación de extractos libres de células

  1. La cosecha de la hoja
    Recoger las áreas inoculadas de la hoja, por lo general aprox. 200-400 mg de peso fresco, y se muelen en un polvo fino en nitrógeno líquido. Alternativamente, bead-vencer a los tejidos, el uso de cualquier grano-batidor (por ejemplo, Biospec) o un amalgamador dental (por ejemplo, TPC Advanced Technologies) directamente en el búfer de degradación (véase el paso 2.2).
  2. La extracción de proteínas
    Preparar el extracto de proteína total mediante la colocación del tejido molido en 500 l de tampón de degradación de [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl 2, DTT 5 mM, adenosina 5 mM 5'-trifosfato, y el inhibidor de la proteasa 1x cóctel (Sigma-Aldrich)]. Tenga en cuenta que el cóctel inhibidor de la proteasa afecta principalmente serina, cisteína, aspártico, y metaloproteasas y no interfiere con la proteasa 26S. Aclarar el extracto mediante dos centrifugaciones secuenciales a 12.000 xg durante 5 min.
  3. Reacción de degradación de proteínas
    Transferencia de volúmenes iguales de extractos de, por lo general 20 l, para microcentrífuga tubos e incubar a temperatura ambiente para aumentar los períodos de tiempo. Típicamente, tiempo de la muestra cero, y 5, 10, 15, 20, y 30 puntos de tiempo min. Deje de reacciones por ebullición en SDS-gel tampón de la muestra, y analizarlos por el Western Blot.
jove_title "> 3. Detección de la degradación de proteínas por inmunotransferencia

  1. La electroforesis en gel
    3.1.1 resolver el muestras de proteína mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y electrotransferencia las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con el protocolo estándar 30.
    3.1.2 Determinar la concentración de proteína por el método de Bradford (Bio-Rad), y la carga de 50 a 80 g de proteína total por carril. Asegúrese de que todas las muestras se cargan por igual. Para los controles de carga, comparar las intensidades de una especie de proteína ubicua, tales como putativo Rubisco grandes cadenas que migran como una banda principal con una movilidad electroforética relativa de alrededor de 50 kDa, ya que pueden ser detectados en geles teñidos de azul de Coomassie o en Ponceau S-o fluorescente SYPRO Rubí teñido con membranas de nitrocelulosa.
  2. Bloqueo
    Bloquear la membrana con 5% de leche descremada en TBST (Tris-HCl 10, NaCl 140 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. El anticuerpo primario
    Diluir anticuerpo anti-epítopo principal en 1% de leche descremada en TBST a la concentración recomendada por el fabricante y se incuba con la membrana se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 º C con agitación suave.
  4. Enjuague
    Enjuague la membrana se enjuagó en 20 ml de TBST durante 15 min una vez, y dos veces durante 5 min a temperatura ambiente con agitación suave.
  5. El anticuerpo secundario
    Diluir anticuerpo secundario (por ejemplo, anti-IgG de conejo) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en 1% de leche descremada en TBST como se recomienda por el fabricante y se incuba con la membrana durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave.
  6. Detección
    Enjuague la membrana de nuevo como se describe en el Paso 3.4. Después del enjuague final en TBST, visualizar las proteínas de interés con un sustrato quimioluminiscente de HRP, más comúnmente usando un kit ECL.

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Resultados

La Figura 1, adaptado de Zaltsman et al. 17, ilustra experimentos representativos para la detección de la degradación proteasomal en un sistema libre de células. En concreto, se demuestra la desestabilización de una planta relacionada con la defensa de proteínas VIP1 por la proteína F-box VBF través de la vía SCF VBF en N. benthamiana. VBF Arabidopsis y HA-etiquetados VIP1 (HA-VIP1) proteínas se coexpresan transitoriamente, y la proteína de conte...

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Discusión

Este ensayo se basa en la expresión de las proteínas de la prueba en tejidos de la planta, por lo tanto, el potencial proceso de degradación proteasomal, obviamente, se produce ya dentro de los tejidos vivos. Nosotros ensayamos la desestabilización de proteínas, sin embargo, sólo en los extractos, con el tiempo de la muestra cero que sirve como el punto de referencia inicial. Por lo tanto, se define como un ensayo libre de células.

Un aspecto importante para el éxito de este ensayo es la ele...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

El trabajo que lleva a esta publicación ha recibido financiación del programa Marie Curie COFUND "U-Mobility", cofinanciado por la Universidad de Málaga y el Programa de la Unión Europea el 7 º Programa Marco (FP7/2007-2013) bajo anestesia general N º 246550. El trabajo en nuestro laboratorio es apoyado por subvenciones del NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD y BSF a VC

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de ensayo de proteínasBio-Rad500-0001
Cóctel de inhibidores de proteinasa Sigma-AldrichS8820
Mini-Sistema proteicoBio-Rad165-8000
Western blot semiseco SD sistema de electrotransferenciaBio-Rad170-3940
Conejo purificado por afinidad Anti-HaICL LabRHGT-45A-Z
Cabra anti-conejo IgG Peroxidasa ConjugadoThermo Scientific31460
BioTrace, NT membrana de transferencia de nitrocelulosaPall Corporation27377-000
Immobilon sustrato HRP quimioluminiscente occidentalEMD MilliporeWBKL S0 050
MG132EMD Millipore474790-1MG
LactacistinaSigma-AldrichL6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL SubstratePierce35055

Referencias

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