El desarrollo de las proteínas de fusión biotinylatable tiene muchas aplicaciones potenciales en diversos campos de la investigación. La ingeniería de proteínas recombinantes es un procedimiento recta hacia adelante que es rentable, proporcionando altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado.
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Artículo de método
Expresión, aislamiento y purificación de soluble e insoluble Biotinylated Proteínas del Tejido Nervioso para regeneración
En este artículo
Resumen
Resumen
La ingeniería de proteínas recombinantes ha utilizado la Escherichia coli (E. coli) sistemas de expresión para casi 4 décadas, y en la actualidad E. coli es todavía el organismo huésped más utilizado. La flexibilidad del sistema permite la adición de restos tales como una etiqueta de biotina (para las interacciones de estreptavidina) y proteínas funcionales más grandes, como la proteína verde fluorescente o la proteína rojo cereza. Además, la integración de los aminoácidos no naturales tales como quelantes de iones metálicos, grupos funcionales reactivos de forma única, sondas espectroscópicas, y moléculas que imparten las modificaciones post-traduccionales ha permitido una mejor manipulación de propiedades de la proteína y funcionalidades. Como resultado de esta técnica crea proteínas de fusión adaptables que ofrecen una utilidad significativa para los distintos ámbitos de investigación. Más específicamente, la secuencia de la proteína biotinylatable se ha incorporado en muchos proteínas diana debido a la alta interacción de afinidad entre la biotina con la avidina y estreptavidina. Esta adición ha ayudado a mejorar la detección y purificación de proteínas etiquetadas, así como abrir el camino para aplicaciones secundarias como la clasificación de células. Así, las moléculas marcadas con biotina muestran una influencia creciente y generalizada en los campos bioindustriales y biomédicas. Para el propósito de nuestra investigación hemos diseñado proteínas de fusión biotinilada recombinantes que contienen el factor de crecimiento nervioso (NGF) y semaphorin3A (Sema3A) regiones funcionales. Hemos informado anteriormente de cómo estas proteínas de fusión biotinilada, junto con otras secuencias de proteínas activas, pueden ser atados a biomateriales para la ingeniería de tejidos y propósitos de regeneración. Este protocolo describe los conceptos básicos de las proteínas biotinylatable ingeniería en la escala de miligramos, utilizando un vector lac inducible T7 y E. Los huéspedes de expresión de E. coli, a partir de la transformación a escala de tratamiento y purificación.
Introducción
Proteínas cubren una amplia gama de biomoléculas que son responsables de muchas funciones biológicas, en última instancia conduce a la formación de tejido adecuado y la organización. Estas moléculas inician miles de vías de señalización que controlan la regulación y / o baja regulación de genes y otras proteínas, mantener el equilibrio en el cuerpo humano. La interrupción de una sola proteína afecta a toda esta red de señales, que puede conducir a la aparición de trastornos o enfermedades devastadoras. Ingeniería de proteínas individuales en el laboratorio ofrece una solución para combatir estos efectos adversos y ofrece una alternativa a los fármacos de moléculas pe....
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Protocolo
1. Proyeccion de proteína diana
- Uso del Centro Nacional para la Información Biotecnológica sitio web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obtener una secuencia de aminoácidos de la proteína diana, teniendo en cuenta las especies de interés y las posibles variantes de empalme. Seleccionar la secuencia de aminoácidos que corresponde a la región activa de interés de la proteína.
Nota: Para Sema3A, se eligieron los aminoácidos 21-747. Una proteína de fusión fue diseñado con NGF en donde la secuencia de barstar, aminoácidos 1-90, se añadió a los aminoácidos 122 a 241 de NGF. - Para la N-terminal añaden las secuencias siguientes: 6X-Su ....
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Resultados
Clonación y expresión de prueba
Cuando chapado se realiza correctamente, colonias aisladas individuales deben formar para aumentar las posibilidades de que el desplume bacterias transformadas clonal de células (Figura 2A). Sin embargo, si se colocan demasiadas células, las placas se incubaron demasiado tiempo a 37 ° C o transformación es cuestionable, las colonias pueden cubrir la placa de agar o formar agregados más grandes de las células (Fig.......
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Discusión
Ingeniería de proteínas recombinantes es una técnica muy poderosa que abarca muchas disciplinas. Es rentable, sintonizable y un procedimiento relativamente simple, lo que permite la producción de altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado. Es importante tener en cuenta que el diseño y la expresión de proteínas diana no siempre es sencillo. La expresión basal y estabilidad de la proteína recombinante dependen de opciones específicas de vector, E. cepas de E. coli de células, adiciones etiqu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Universidad de Akron para el financiamiento que apoya este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-Hidroxietilmercaptano β-Mercaptoetanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| Ácido acético, glacial | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
| Agar | Bioshop AGR001.500 | 500 g | |
| Ampicilina sal sódica | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
| Antiespumante 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 y micro; g | |
| BL21(DE3) Células Competentes | Novagen | 69450 | 1 ml; Expression Host |
| Bradford reactivo | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| Estándar de filtración en gel | Bio-Rad | 151-1901 | 6 viales |
| Glicerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| Hidrodioruro de guanidina clorhidrato de amioformamidina | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| His-Pur Ni-NTA Resina | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| Ácido clorhídrico | EMD | HX0603-3 | 2,5 L |
| Imidazol | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Tampón de muestra Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| Lauril sulfato sódico sal, Superficie dodecilo de sodio | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB Caldo | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
| Células Competentes NovaBlue | Novagen | 69825 | 1 ml; Clonación Huésped |
| Fosfato tamponado solución salina | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 paquete |
| Cloruro de potasio | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 y micro; g | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
| Hidróxido de sodio | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| Fosfato de sodio diabásico | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
| Fosfato de sodio monobásico | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
| Caldo Terrific | Bioshop TER409.5 | 5 kg | |
| Clorhidrato de tetraciclina | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
| Tampón Tris/Glicina/SDS, 10x | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| Triptona, pancreática | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
| Extracto de levadura, granulado | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
| Ä KTApurificador10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | Incluye kits y accesorios |
| Agitador orbital de sobremesa | Thermo Scientific | SHKE4000 MAXQ 4000 | |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | Enzyme viene con tampones de reacción y solución de biotina |
| Casette de diálisis | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
| Tubo de | diálisisSpectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25.000 y 50.000 |
| Válvula de desvío de flujo FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter Kit de ensayo de cuantificación de biotina | Invitrogen 1094598 | ||
| Frac-950 Bastidores de tubos, bastidor C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| Colector de fracciones Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | Incluye kits y accesorios |
| Circulador calefactado/refrigerado | VWR | 13271-102 | Modelo 1156D |
| Horno de calentamiento Serie FD | Aglutinante | Modelo FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | Descontinuado--Producto de reemplazo: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Centrífuga Avanti Beckman | Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 Rotor | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 Rotor | Beckman Coulter 969329 | Incluye botellas de poliporpileno de 1 L | |
| JS 5.3 Rotor Beckman | Coulter | 368690 | |
| Campana de flujo laminar | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 Series Clean Bench Lector |
| microplacas | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4 geles verticales sistema de electroforesis |
| Mini-PROTEAN TGX Geles prefabricados | Bio-Rad | 456-9036 | Cualquier kDa, peine de 15 pocillos |
| Columna de Ni-NTA | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml volumen ECONO-Kit de |
| minipreparación de plásmido de columna | Omega Bio-Tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC Fuente | de alimentación Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| Tubos de copolímero de polipropileno de fondo redondo | VWR | 3119-0050 | 50 ml tubos para rotor JA 25.50 |
| Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 y 6 ml; MWCO: 10.000 da |
| Servicio de subclonación | GenScript USA Inc. | servicios de proteínas | |
| Cole-Parmer | 18910445A | Modelo CV18 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Modelo G560 |
Referencias
- Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
- Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....
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Reimpresiones y permisos
