El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

Tammy A. Butterick; Cayla M. Duffy; Rachel E. Lee; Charles J. Billington; Catherine M. Kotz; Joshua P. Nixon

doi:10.3791/51305

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Artículo de método

El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

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DOI:

10.3791/51305

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16 de abril de 2014

Tammy A. Butterick¹^,² , Cayla M. Duffy¹^,² , Rachel E. Lee³ , Charles J. Billington¹^,²^,⁴ , Catherine M. Kotz¹^,² , Joshua P. Nixon¹^,²

¹Department of Veterans Affairs, Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, ²Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, ³Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, ⁴Department of Medicine, University of Minnesota Medical School, University of Minnesota

En este artículo

Resumen

Ensayos multiplex pueden proporcionar información útil para los mecanismos celulares básicos y eliminar los residuos de los reactivos y experimentos repetitivos innecesarios. Se describe aquí un múltiplex de la caspasa-3/7 ensayo de actividad, utilizando métodos fluorescentes y luminiscentes basados en, para determinar la viabilidad celular en un modelo hipotalámico in vitro después de desafío oxidativo con ácido palmítico.

Resumen

La capacidad de multiplexar ensayos en los estudios de los mecanismos celulares complejas elimina la necesidad de experimentos repetitivos, proporciona controles internos, y disminuye los residuos en los costos y los reactivos. Aquí se describe la optimización de un ensayo múltiple para evaluar la apoptosis después de un ácido palmítico (PA) en un modelo de desafío hipotalámico in vitro, usando tanto fluorescente y luminiscente basada en ensayos para medir el recuento de células viables y la caspasa-3/7 actividad en un 96-así formato de placa de microtitulación. Después de la exposición PA, las células viables se determinaron por un ensayo fluorescente basado en resazurina. La caspasa-3/7 actividad fue luego determinado utilizando un sustrato luminógeno, DEVD, y se normalizó al número de células. Este ensayo multiplexado es una técnica útil para determinar el cambio en la actividad de la caspasa después de un estímulo apoptótico, tales como desafío ácido graso saturado. El ácido graso saturado PA puede aumentar el estrés oxidativo del hipotálamo y la apoptosis, lo que indica el potencial de importaciónNCE de ensayos tales como el que se describe aquí en el estudio de la relación entre los ácidos grasos saturados y la función neuronal.

Introducción

Las dietas ricas en ácidos grasos saturados, como el ácido palmítico (PA) se han relacionado con la obesidad y otras comorbilidades, como la enfermedad cardiovascular y la diabetes ^{1, 2.} Las dietas altas en grasa también se ha demostrado que aumentar el estrés oxidativo, la apoptosis, y la degeneración neuronal en el hipotálamo, un importante regulador del apetito y el gasto de energía ^3-7. Entender el mecanismo a través del cual la exposición dieta rica en grasas induce desregulación hipotalámica tanto, es importante para el desarrollo de tratamientos farmacológicos para la obesidad. Sin embargo, los mecanismos celulares a través del cual la gr....