Una interferencia de ARN de doble cadena (dsRNAi) técnica se emplea para regular a la baja la coenzima A reductasa cinamoilo maíz gen (ZmCCR1) a un menor contenido de lignina de la planta. La lignina regulación a la baja de la pared celular se visualiza mediante análisis microscópicos y se cuantifica por el método de Klason. Se analizan los cambios de composición de la hemicelulosa y la celulosa cristalina.
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Artículo de método
La lignina Down-regulación de
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Resumen
Resumen
Para facilitar el uso de la biomasa lignocelulósica como un recurso bioenergía alternativa, durante los procesos de conversión biológica, se necesita una etapa de pretratamiento para abrir la estructura de la pared celular de la planta, el aumento de la accesibilidad de los hidratos de carbono de la pared celular. La lignina, un material polifenólico presente en muchos tipos de pared celular, se sabe que es un obstáculo significativo a la enzima de acceso. Reducción en el contenido de lignina a un nivel que no interfiere con la integridad y la defensa del sistema estructural de la planta puede ser un paso importante para reducir los costes de la producción de bioetanol. En este estudio, hemos genéticamente las reguladas uno de los genes relacionados con la biosíntesis de lignina, cinamoil-CoA reductasa (ZmCCR1) a través de una técnica de interferencia de ARN de doble cadena. El constructo ZmCCR1_RNAi se integró en el genoma del maíz utilizando el método de bombardeo de partículas. Plantas de maíz transgénicas crecieron normalmente en comparación con las plantas de control de tipo salvaje y sin enterfering con el crecimiento de la biomasa o los mecanismos de defensa, con la excepción de la visualización de color marrón-coloración en plantas transgénicas hoja mediados de los nervios, las cáscaras y tallos. Los análisis microscópicos, en conjunción con el ensayo histológico, revelaron que las fibras de esclerénquima de hojas se apretó pero la estructura y el tamaño de otros componentes principales del sistema vascular no fue alterada. El contenido de lignina en el maíz transgénico se redujo en un 7-8,7%, se aumentó el contenido de celulosa cristalina en respuesta a la reducción de la lignina, hemicelulosas y se mantuvo sin cambios. Los análisis pueden indicar que el flujo de carbono podría haber sido desplazado de la biosíntesis de la lignina para la biosíntesis de la celulosa. Este artículo delinea los procedimientos utilizados para regular a la baja el contenido de lignina en el maíz a través de la tecnología del RNAi, y los análisis de la composición de la pared celular utilizado para verificar el efecto de las modificaciones en la estructura de la pared celular.
Introducción
La producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica es altamente deseable debido a su abundancia actual en los EE.UU. 1, y en el caso de la cosecha sostenible de los residuos agrícolas y forestales, la capacidad de no competir directamente por las tierras de cultivo utilizado para la alimentación animal y la producción de piensos. Sin embargo, a diferencia de grano de maíz, que es la principal fuente de biocombustible se está generando en los EE.UU., los materiales lignocelulósicos son significativamente más complejo y difícil de romper. Además de la hidratos de carbono de cadena larga, celulosa y hemicelulosa, que son las principales fuen....
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Protocolo
1. Preparación de dsRNAi construcciones utilizadas para el descenso de regulación de ZmCCR1
- Primers específicos de genes de diseño que incluyen sitios de enzimas de restricción necesarios para hacer una dsRNAi construir a ronda el gen ZmCCR1. Dos conjuntos de cebadores fueron diseñados para amplificar dos segmentos de fragmentos de ADNc ZmCCR1:. Un fragmento de 523 pb desde el nucleótido 748 hasta 1271, y un fragmento de 285 pb desde el nucleótido 986 hasta 1271 El ADNc ZmCCR1 fue proporcionada por el Instituto del Genoma de Arizona (AGI). Más detalles se describen en la Figura 1.
- Amplificar el....
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Resultados
Hemos demostrado una reducción en el contenido de lignina en las plantas de maíz a través de ARNi. El método de transformación por bombardeo de partículas produjo alrededor del 30% de eficiencia trnasformation. El silenciamiento de los genes de ZmCCR1 se observó consistentemente en generaciones T0-T2. Los transgénicos lignina reducida crecieron de manera similar a las plantas de maíz de tipo salvaje, excepto para la visualización de la coloración marrón en el medio de la hoja de la costilla, la cáscara y tallo........
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Discusión
La accesibilidad de las celulasas microbianas para plantar polisacáridos de la pared celular depende en gran medida del grado en el que se asocian con polímeros fenólicos 23. La tasa de conversión de biomasa lignocelulósica en azúcar fermentable se correlaciona negativamente con el contenido de lignina depositado en las paredes celulares de las plantas secondadry. Esta correlación se atribuye a las propiedades físicas de la lignina como hidrofobicidad 24, la heterogeneidad química, y la ausencia de.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
La imagen microscópica se realizó a través de los servicios del Centro de la Universidad Estatal de Michigan de Microscopía Avanzada. Callos de maíz fue adquirido desde el Centro de Transformación de maíz de Iowa State University. Los autores desean agradecer a Jeffrey R. Weatherhead del Laboratorio de Investigación de Plantas MSU por su asistencia técnica en el análisis de carbohidratos. Esta investigación fue generosamente financiado por el Programa de Maíz de Marketing de Michigan (CMPM) y el Consorcio para la Investigación de Biotecnología Vegetal (CPBR).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| N6OSM (medio osmótico) | Hecho internamente | ||
| N6E (inducción de callos) | Hecho internamente | ||
| Medios N6S (Medios de selección) | Hecho internamente | ||
| Medio | Hecho internamente | ||
| Medio de enraizamiento | Hecho internamente | ||
| 10% Formalina tamponada neutra (1 L) | Dispositivo de | ||
| entrega de partículas Bio-Rad PSD-1000/He | Hércules, CA, Estados | ||
| Microscopio láser confocal Zeiss PASCAL | Carl Zeiss, Jena, Alemania | Para la microscopía de campo claro, las imágenes se registraron utilizando un microscopio láser de barrido confocal Zeiss (Jena, Alemania) con un espejo de excitación de 488 nm, un filtro de emisión de 560 nm y un filtro de emisión de 505-530 nm. El análisis de las imágenes se realizó con el microscopio láser de barrido PASCAL LSM versión 3.0 SP3. | |
| Procesador de tejidos Excelsior ES | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, Estados | ||
| Estación de inclusión HistoCentre III | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, Estados | ||
| Modelo de micrótomo Reichert 2030 | Reichert, Depew, NY, Estados | ||
| Emscope Sputter Coater modelo SC 500 | Ashford, Kent, Inglaterra | ||
| JEOL JSM-6400V Microscopio electrónico de barrido | JEOL Ltd., Tokio, Japón | ||
| Fitzpatrick JT-6 Molino homoloide | Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL | ||
| Analizador de humedad MA35 | Sartorius | ||
| Secador de punto crítico, Balzers CPD | Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, Estados | ||
| Tubos de alta presión con | tapa de roscaAce Glass, Vineland, NJ | #8648-27 | |
| Tapones de tubo de alta presión con tapa de rosca | Ace Glass, Vineland, NJ | #5845-47 |
Referencias
- Perlack, R. D., et al. USDA-DOE. Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry: The technical feasibility of a billion-ton annual supply. , Available from: http://feedstockreview.ornl.gov/pdf/billion_ton_vision.pdf (2005).
- Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. Lignin-ferulate cross-links in grasses - Act....
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Reimpresiones y permisos
