La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Nanomateriales artificiales son hoy en día inspiran el interés de los científicos de la vida para potenciales aplicaciones en biomedicina ^1. Una amplia variedad de materiales inorgánicos y orgánicos se puede utilizar para producir nanoestructuras con diferentes formas, físicas y características químicas. Entre estas estructuras, las nanopartículas de ingeniería de forma esférica demostraron un gran potencial para la medicina de diagnóstico y de la traducción ^2. Su núcleo y diseño de la superficie son impulsados ​​por una posible aplicación e implica un profundo estudio de las respuestas de células diana tras el contacto y la interacción de las nanopartículas. Las nanopartículas que se piensan para ser administrado deliberadamente a seres humanos entrarán en contacto directo con varios tipos de células del sistema inmune. Su responsabilidad de mantener la integridad corporal ellas un tema crucial de la investigación en nanomedicina ³ hace.

La parte celular del sistema inmune innato está representada principalmente por fagocitos. Entre ellos, el linaje de los monocitos / macrófagos células derivadas, incluidos los nerviosos residentes microglia centrales del sistema, juegan un papel clave en la defensa inmune ^4,5. Ellos son capaces de desencadenar respuestas protectoras dentro de pocas horas después de encontrarse con cuerpos extraños. Por otra parte, las células monocíticas coordinar e instruir a la respuesta inmune adaptativa a través de la liberación de citoquinas. Todos estos eventos se producen incluso en presencia de materiales de ingeniería, que se perciben en gran medida como "no propio" por el sistema inmune ^6.

Entre los métodos utilizados históricamente en la inmunología para el análisis celular, citometría de flujo representa una de las herramientas más poderosas. Además, la disponibilidad de tecnologías para la identificación o purificación de una subpoblación inmune específica (a menudo explotando la exclusión o la presencia de una proteína de membrana individual) permite una investigación precisa de los efectos de un cierto nanopartículas en que ce primaria en particularll tipo ^7. Sin embargo, las células pueden presentar alteraciones fisiológicas y morfológicas después de la exposición a las nanopartículas. Además, las nanopartículas pueden interferir con parámetros ópticos específicos, tales como absorción o emisión de luz a longitudes de onda definidas, que influyen en los resultados obtenidos ^8. Por lo tanto, límites de utilización ya las adaptaciones eventuales de ensayos inmunológicos clásicos en el estudio de nuevos materiales deben ser considerados.

Este trabajo se refiere a la detección de interacciones de nanopartículas con células inmunes primarias por citometría de flujo. Para abordar esta cuestión, el 50 nm FITC-SiO ₂ nanopartículas se emplean como modelo nanomaterial para describir el método. Las partículas de sílice pueden ser producidas de una manera muy precisa en la escala nanométrica. Tamaño, forma, y propiedades superficiales, tales como carga o hidrofobicidad, se pueden finamente sintonizados para aumentar su biocompatibilidad ^9. Muchas de las características de SiO ₂ nanopartículas les permiten ser utilizados como unmodelo para la administración de fármacos partículas ^10. Además, los tintes fluorescentes o puntos cuánticos pueden ser atrapados o vinculadas a estas partículas que ofrecen útiles nano-herramientas para los propósitos de formación de imágenes ^11.

ÉTICA DE MOTIVOS

Se procesaron muestras humanas y animales siguiendo las directrices del Ministerio de Salud de Italia, la ley 116/92 y la Directiva del Consejo Europeo de Comunidades 86/609/CEE.

1. Monocitos culturas celulares

1. Cultura humanos células THP-1 en matraces T-75 que contenían medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero humano, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina, 0,05 mM β-mercaptoetanol a 37 ° C en 5% de CO _2.
2. Culturas Dividir cuando confluente (cada 3-5 días).

2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de Buffy Coats

1. Antes de iniciar el protocolo de aislamiento, preparar una solución de tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,2, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA), la adición de 5 ml de BSA de la solución a 95 ml de disolución tampón de enjuague (1: 20 de dilución). Desgasificar el búfer y mantenerlo frío (2-8° C).
   IMPORTANTE: Si no se desgasificar el tampón puede resultar en menos de óptima resultados porque las burbujas pueden bloquear la columna de la aislamiento (véase el paso 3.2).
   Nota: Anticoagulante fórmula-A citrato dextrosa (ACD-A) o citrato fosfato dextrosa (CPD) se puede utilizar alternativamente. Por el contrario, otras proteínas de albúmina o sueros de otras especies pueden sustituir de BSA. No use tampones que contienen Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +.}
2. Obtener buffy abrigos de donantes sanos (edad 20-60 años).
3. Preparar los tubos de 50 ml cónicos para la densidad de centrifugación en gradiente. Determinar el número de tubos requeridos para el procesamiento de la sangre (cada tubo puede procesar 35 ml de sangre diluida) y añadir 15 ml de Ficoll-Paque a cada tubo de vacío.
4. Diluir 8 ml de sangre con 24 ml de solución de PBS / BSA / EDTA (1:04 dilución).
5. Capa cuidadosamente la solución diluida en la parte superior de Ficoll-Paque (densidad = 1,077 g / ml) en cada uno de los tubos de 50 ml cónicos. No mezclela sangre y de Ficoll-Paque.
   IMPORTANTE: Para evitar la mezcla de la sangre y de Ficoll-Paque, mantenga el tubo en un ángulo de 45 ° y la capa de la mezcla de la sangre lentamente.
6. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a 4 ° C. Las células mononucleares (MNC) permanecerán en la interfase de plasma de Ficoll-Paque, mientras que los granulocitos y los eritrocitos de sedimentos debido a la mayor densidad en la presión osmótica de Ficoll-Paque.
7. Transferencia de las células en interfase (células mononucleares de sangre periférica, PBMC) a un nuevo tubo de 50 ml llena con PBS / BSA / EDTA y se centrifuga a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
8. Lavar la pella dos veces con PBS / BSA / EDTA para eliminar las plaquetas. Girar a 200 xg durante 10 min a 4 ° C.
9. Cultivar las células en RPMI-1640 completo con un 10% de suero humano y antibióticos o proceder a la purificación de monocitos.

3. Purificación de los monocitos primaria a partir de PBMCs

1. Aislar los monocitos de PBMC por separación de perlas magnéticas usando Humun kit de aislamiento de monocitos Pan:
   1. Pasar las células a través de una malla de 30 micras de nylon (filtros separación previa, 30 m) para eliminar los posibles grupos de células.
   2. Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro.
   3. Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Aspirar el sobrenadante por completo.
   4. Sedimento celular Resuspender en 30 l de tampón de PBS / EDTA / BSA por 10 ⁷ células totales.
   5. Añadir 10 l FcR reactivo de bloqueo por 10 ⁷ células totales.
   6. Añadir 10 l de cóctel de biotina-anticuerpo por 10 ⁷ células totales.
   7. Mezclar bien e incubar durante 5 minutos a 2-8 ° C.
   8. Añadir 30 l de tampón por 10 ⁷ células totales.
   9. Añadir 20 l de anti-biotina microperlas por 10 ⁷ células totales.
   10. Mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 2-8 ° C.
   11. Resuspender hasta 10 ⁸ células en 500 l de tampón PBS / EDTA / BSA.
2. Separ magnéticaación
   1. De acuerdo con el número total de células, elija una columna MACS apropiado y MACS Separador (ver columna MACS hoja de datos).
   2. Colocar la columna en el campo magnético del MACS separador.
   3. Preparar la columna por lavado con la cantidad apropiada de tampón PBS / EDTA / BSA (MS columnas: 500 l; columnas LS: 3 ml).
      Nota: Las columnas son "parar flujo" y no se secan.
   4. Aplicar la suspensión celular en la columna. Recoger de flujo continuo que contiene células no marcadas, que representa la fracción de monocitos enriquecidos.
   5. Lavar la columna 3 veces con tampón PBS / EDTA / BSA (500 l para la EM y 3 ml de LS por lavado).
   6. Recoger las células no marcadas que atraviesan, en representación de los monocitos enriquecidos, y añadir al flujo a través de la sección 3.2.4.
      Nota: Lavar la columna mediante la adición de alícuotas de tampón PBS / EDTA / BSA solamente cuando el depósito columna está vacía.
   7. (Opcional) Quite la columna de laseparador y colocarlo en un tubo de recogida adecuado. Pipetear la memoria intermedia en la columna (MS columnas: 1 ml, esbeltas columnas LS: 5 ml). Inmediatamente enjuagar las células marcadas magnéticamente nonmonocyte empujando firmemente el émbolo en la columna.
   8. Cultura purificó monocitos en RPMI-1640 completo con 10% de suero humano y antibióticos.

4. Purificación de los monocitos primarios de sangre entera

1. Purificar los monocitos de la sangre entera usando el kit de aislamiento de monocitos de sangre entera siguiendo las instrucciones del fabricante.

5. Internalización de nanopartículas en leucocitos de sangre y se purificaron monocitos

1. Plate 5 x 10 ⁵ células / ml (1 ml / pocillo) de las PBMCs aisladas o los monocitos CD14 positivos purificados en una placa de 12 pocillos.
2. Vortex _FITC-SiO2 nanopartículas de solución madre y volver a suspender en medio completo a una concentración de trabajo de 100 nM.
3. Añadir 10 l de nanop trabajosuspensión artículo (100 nM) para las muestras tratadas para llegar a una concentración final de nanopartículas de 1 nM. Añadir el mismo volumen de medio completo para los controles sin tratar a cada pocillo.
4. Después de 1 hora internalización recoger las muestras en un tubo de polipropileno de 1,5 ml y centrifugar ellos durante 3 min a 6000 x g a temperatura ambiente.
5. Lavar el pellet con 1 ml de tampón de 3 min a 6000 x g a temperatura ambiente.
6. Resuspender el sedimento en 200 l de tampón. Las células están listas para su lectura por citometría de flujo.

6. Aislamiento de mezcla de culturas gliales primarios (Ver Bertero et al. ⁷⁾

7. Replating una mixta gliales confluentes de Cultivos Celulares

1. Lave un frasco T-75 una vez con 10 ml de PBS (w / o Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +),} a continuación, añadir 10 ml de Versene y se incuba a 37 ° C durante 5-7 min.
2. Pipetear el sobrenadante arriba y hacia abajo varias veces con el fin de separar las células de la superficie T-75 y disolverlos agregados de células.
3. Transferir la suspensión celular en un tubo de polipropileno de 15 ml. Se recoge una pequeña cantidad de la suspensión celular para contar las células con un hemocitómetro.
4. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet a una concentración final de 5 x 10 ⁵ células / ml en medio de cultivo completo de la glía.
6. Placa 0,5 ml / pocillo en una placa de 24 pocillos y dejar que las células se asientan durante 2-4 horas antes del tratamiento de nanopartículas.

8. Nanopartículas Internalización en Microglia

1. Añadir 500 l de medio de cultivo glial completa (para los controles no tratados) o 500 l de una suspensión 2x _{Rodamina-SiO2} de nanopartículas en medio de cultivo glial completa (para muestras tratadas) a cada pocillo.
2. Pipetear las células para permitir la separación de las células-nonrapid la adhesión en los puntos de tiempo seleccionados y recoger en tubos de polipropileno de 2 ml.
3. Añadir 500 lde Versene a cada pocillo y se incuba la placa a 37 ° C durante 5 min, a continuación, separar la fracción celular restante y recoger cada muestra con las células no adherentes correspondientes de la etapa anterior.
4. Centrifugar las muestras durante 3 min a 300 x g a temperatura ambiente.
5. Resuspender el sedimento en 100 l de tampón de AutoMACS.

9. La tinción con CD11b-VioBlue

1. Añadir 10 l de VioBlue-CD11b anticuerpo humano / ratón para 100 l de suspensión celular (1:11 ratio) en tampón y se incuba 10 min a 4 ° C.
2. Añadir 1 ml de tampón y mezclar la suspensión de células.
3. Centrifugar cada muestra durante 3 min a 300 x g.
4. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 100 a 150 l de tampón.
5. Lea las muestras al citómetro (almacenar las muestras a 4 ° C entre los dos últimos pasos).
   IMPORTANTE: antes de analizar las muestras, proceda a la reparación de las señales superpuestas iLos espectros de emisión de N observó entre diferentes fluorocromos (nanopartículas o anticuerpos conjugados con fluorocromo).

10. Derrame espectral sobre la compensación

1. Abra el cuadro de "Ajustes del instrumento" (presente en todos los programas de software del instrumento).
   Nota: Si está usando un instrumento diferente de la que se informa en la Tabla de materiales, por favor consulte el manual específico de instrumento para los detalles de adquisición.
2. Adquirir muestra sin tratar (sin nanopartículas) a velocidad de fluidos de baja (si es permitido por el instrumento). Durante la adquisición, ajuste manualmente hacia adelante y la dispersión lateral (FSC y SSC, respectivamente) mediante la regulación de los canales de tensión.
   Nota: Modificar las escalas de los ejes del SSC y del FSC con el fin de visualizar mejor la población celular completa en la trama. Un ajuste de plantilla para cada tipo celular de interés de instrumentos puede crearse, guardarse y utilizarse para futuras adquisiciones.
3. Abra la específicaFicha "región" en el software. Dibuje una región grande adecuada ("gate") alrededor de la población deseada.
   Nota: Internalización de nanopartículas induce un cambio SSC de las células. Si la puerta está demasiado estrechamente restringido alrededor de la población celular de interés, los datos adquiridos probablemente pierda parte de las células para ser detectados.
4. Utilice dos muestras no teñidas, uno para su uso como blanco de muestra y uno para la compensación contra la tinción PI (opcional), una muestra de un solo manchado con el fluorocromo apropiado para cada canal de fluorescencia a ser compensado.
   Nota: Use un tubo de muestra de 1,5 ml diferente para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo para ser utilizado en el etiquetado experimento.
5. Abra la pestaña "Compensación" en la casilla "Configuración del instrumento". Aumentar o disminuir el factor de compensación durante la adquisición hasta que la intensidad de fluorescencia en el canal de contagio es más o menos lo mismo para el pos fluorocromoitive y negativo de la población.
6. Adquirir muestras de nanopartículas tratadas después de la compensación se ha ajustado.

La citometría de flujo es una herramienta útil para identificar y caracterizar las diferentes células y es la técnica de elección para identificar las células inmunitarias específicas, tales como monocitos, granulocitos, células T, células B, células asesinas naturales (NK), células dendríticas (DCs), y otras subpoblaciones de leucocitos.

En el esfuerzo para caracterizar mejor el comportamiento de las células blancas de la sangre en respuesta a las nanopartículas, se realizaron ensayos de internalización con leucocitos primarias aisladas de la sangre de donantes sanos (Figuras 1 y 2) y con la línea celular de monocitos humana (células THP-1, la Figura 3) .

Como se informó en la Figura 1A, los tres principales subpoblaciones de leucocitos en sangre fueron claramente identificados por el delantero y la dispersión lateral después de aislar PBMCs. Por otra parte, después de FITC-SiO2 tratamiento, linfocitos (gris), monocitos (azul) y granulocitos (rojo) tienen una diferente ntasa de internalización anoparticle como se muestra por la intensidad de fluorescencia verde (Figura 1B). El protocolo descrito permite la purificación de CD14 monocitos positivos primarios a partir de PBMCs. Figura 2A informa de la citometría de flujo gráfico de puntos de monocitos CD14 + en presencia de FITC-SiO2. Figura 2B muestra FITC-SiO2 internalización cuantificado en las mismas células y expresado en histograma escala logarítmica.

Experimentos de internalización similares se realizaron en células THP-1 monocitos tratados con concentraciones crecientes de FITC-SiO 2 nanopartículas. Las células no tratadas se utilizaron como control negativo. Figura 3A muestra un aumento dependiente de la dosis en la dispersión de sus superficies con un avance sin cambios dispersión en THP-1 línea celular. En la Figura 3B, junto con los histogramas de SSC y FSC en cada FITC-SiO concentración de 2 nanopartícula probado, intensidad de fluorescencia media (MSe presenta FI) cuantificación. Estos datos sugieren que el tratamiento con FITC-SiO 2 nanopartículas induce una internalización dependiente de la dosis en monocitos resaltados por el aumento de la granularidad intracelular (dispersión lateral) y de fluorescencia (canal verde).

Para obtener más conocimientos sobre el tipo de interacción entre las células inmunes y las nanopartículas, se aislaron mezcla de culturas gliales primarios y microglia, las células inmunes residentes del sistema nervioso central, se purificó. El uso de un modelo de ratón transgénico que expresa la microglía verde fluorescente permite la visualización de diferentes mecanismos neuro-inflamatoria. El ratón transgénico B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J utilizado en este trabajo expresa la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de CX3CR1 12. Después de 7 días in vitro (DIV), microscopía de fluorescencia muestra un cultivo glial primario mezclado con una gran cantidad de astrocitos (células adherentes negativo de GFPs) y algunas células de verde (GFP positivo, Figura 5A). En este modelo de ratón, tres subpoblaciones gliales se pueden distinguir por citometría de flujo con una única tinción CD11b-anticuerpo: la primera CD11b - GFP - (astrocitos y otras células gliales), un segundo grupo distinto de las células microgliales CD11b + GFP +, y una tercero GFP CD11b + - subpoblación (Figura 4A). Estos dos últimos subpoblaciones son ambos capaces de internalizar nanopartículas con un ligero aumento de la eficiencia por la GFP + población (que representa el patrullando la microglía inmaduro por la transcripción del promotor de CX3CR1), como se muestra por análisis de citometría de flujo (Figura 4B). La internalización producido se puede verificar adicionalmente mediante microscopía confocal usando la misma concentración final de Rodamina-SiO 2 nanopartículas como se muestra en la Figura 5B.

2 internalización de nanopartículas en CD14 + monocitos purificados. A) hacia adelante Representante dispersión (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) citometría de flujo diagrama de puntos de los monocitos CD14 positivos purificados. B) La fluorescencia verde histograma parcela de la subpoblación de monocitos purificados en presencia de 1nM FITC-SiO 2 nanopartículas (45 mV) durante 1 hora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Efectos de la FITC-SiO2 nanopartícula internalización en células THP-1. A) hacia adelante Representante dispersión (FSC) frente scatterin ladog (SSC) citometría de flujo diagrama de puntos de células THP-1 línea celular de monocitos, después de 1 h de exposición de FITC-SiO2 nanopartículas creciente concentración. B) variación dependiente de la concentración de la dispersión lateral (SSC), la dispersión hacia adelante (FSC) y verde fluorescencia en presencia de FITC-SiO 2 nanopartículas (45 mV) durante 1 hora. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Rodamina-SiO2 nanopartícula internalización en primaria microglia aisladas de B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J ratones. A) proteína fluorescente verde (GFP) en comparación con el flujo de CD11b-VioBlue citometría gráfico de puntos de prglia mixta imary aislado de B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J ratones. CD11b + GFP + y CD11b + GFP - poblaciones se muestran en la parte superior derecha y el cuadrante inferior derecho, respectivamente B) fluorescencia roja superpuesta histograma parcela de subpoblaciones microglia en presencia de 1 nM rodamina-SiO2 nanopartículas (45 mV) de 30. min (histograma rojo) versus control (histograma gris). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Visualización de GFP + microglia. (A) Microscopía de fluorescencia a 7 DIV y (B) La microscopía confocalde Rodamina-SiO2 nanopartícula internalización (flechas rojas) en GFP +-microglia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que Miltenyi Biotech GmbH ha patrocinado la presentación de este manuscrito. HiQ-Nano Company ( http://www.hiq-nano.com/index.html ) es un spin off de la nanotecnología empresa surgida de IIT.