La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo
28 de marzo de 2014
Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.
El objetivo general de este procedimiento es detectar las interacciones de nanopartículas fluorescentes con subpoblaciones primarias de células inmunitarias mediante citometría de flujo. Esto se logra primero tratando las células de interés con las nanopartículas. En el siguiente paso, las células se marcan con un anticuerpo contra marcadores superficiales específicos de cada célula y luego se analizan mediante citometría de flujo.
Por último, se puede medir la interacción de las nanopartículas con poblaciones individuales de células inmunitarias. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía es que con ella se pueden cuantificar las variaciones en las intensidades de fluorescencia inducidas por las nanopartículas en poblaciones celulares no adherentes. Para la internalización de nanopartículas en leucocitos sanguíneos o monocitos purificados, comience por sembrar cinco veces 10 a la quinta de las células de interés en un mililitro por pozo, en cada pozo de una placa de 12 pozos.
Luego, agregue 10 microlitros de una suspensión recién preparada de nanopartículas fluorescentes de dióxido de silicio en trabajo a cada pocillo experimental, añadiendo también en este momento un volumen igual de medio completo a los pocillos de control no tratados. Después de una hora de internalización a 37 grados Celsius, transfiera las muestras a tubos individuales de polipropileno de 1,5 mililitros y luego centrifugue las muestras durante tres minutos a 6.000 × g y temperatura ambiente para teñir las células con CD14 mediante una incubación azul: incube 100 microlitros de cada suspensión celular con 10 microlitros del anticuerpo humano en una proporción de 1 a 11 en tampón de lavado durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Tras eliminar el anticuerpo no unido mediante lavado con un mililitro de tampón de lavado, re suspenda las células en 200 microlitros de tampón de lavado fresco para su análisis por citometría de flujo.
A continuación, para configurar la compensación del derrame espectral, abra el cuadro de configuración del instrumento en el software de citometría de flujo y luego adquiera una muestra sin anticuerpo, sin nanopartículas y sin etiquetado a baja velocidad fluidica. Ajustar los parámetros de compensación en presencia de nanopartículas fluorescentes es la parte más complicada del procedimiento, ya que las nanopartículas pueden interferir con la dispersión lateral; para asegurar el éxito, debe definirse manualmente una compuerta de la población celular de interés. Ajuste manualmente la dispersión directa y lateral regulando los canales de voltaje. Luego, dibuje una compuerta adecuadamente grande alrededor de la población celular deseada.
Cargue otra muestra no etiquetada y abra la pestaña de compensación en el cuadro de configuración del instrumento. Ajuste el factor de compensación durante la adquisición hasta que la intensidad de fluorescencia en el canal de desbordamiento sea aproximadamente la misma para las poblaciones positivas y negativas del fluorocromo. Finalmente, tras ajustar la compensación para cada tubo de control marcado individualmente con un solo fluorocromo, lea las muestras tratadas con nanopartículas con el fin de caracterizar mejor el comportamiento de los glóbulos blancos frente a las nanopartículas; se realizaron ensayos de internalización tal como se acaba de demostrar.
Por ejemplo, en este experimento representativo, tres subpoblaciones principales de leucocitos sanguíneos se identificaron claramente mediante dispersión frontal y lateral tras el aislamiento de PBMC. Además, tras el tratamiento con dióxido de silicio fz, linfocitos, monocitos y granulocitos mostraron tasas diferentes de internalización de nanopartículas, indicadas por su intensidad de fluorescencia. En estas imágenes, se demuestra la internalización de nanopartículas en monocitos primarios positivos para CD14 purificados de pbmc.
Estos diagramas de dispersión muestran monocitos positivos para CD14 en presencia de nanopartículas de dióxido de silicio de Fitz. El histograma ilustra la cuantificación de las células positivas para Fitzy expresadas como intensidad de fluorescencia. Se realizaron experimentos de internalización similares con monocitos TP1 tratados con concentraciones crecientes de nanopartículas de dióxido de silicio de Fitz, utilizando células no tratadas como control negativo.
Los gráficos de puntos ilustran el aumento dependiente de la dosis en la dispersión lateral con una dispersión hacia adelante invariable en la línea celular TP uno tras la internalización de nanopartículas. Los datos de estas gráficas sugieren que el tratamiento con nanopartículas de dióxido de silicio de Fitz induce una internalización dependiente de la dosis en monocitos, destacada por el aumento de la granularidad intracelular. Para obtener mayor información sobre las interacciones entre células inmunitarias y nanopartículas, se cultivaron microglías durante siete días in vitro y se incubaron con nanopartículas durante una hora. La microscopía de fluorescencia indicó un cultivo mixto primario de células gliales con un gran número de astrocitos no adherentes GFP negativos y algunas células GFP positivas.
En este experimento representativo, se pudieron distinguir tres subpoblaciones gliales mediante citometría de flujo con una única tinción con el anticuerpo CD11B que marca CD11B, astrocitos GFP negativos negativos para CD11B y otras células gliales, células microgliales CD11B positivas y GFP negativas, y una subpoblación CD11B positiva y GFP positiva. Las dos últimas subpoblaciones son capaces de internalizar nanopartículas, con una ligera mayor deficiencia por parte de la población GFP positiva. La internalización de nanopartículas puede verificarse además mediante microscopía confocal, como se demuestra en esta imagen utilizando nanopartículas de dióxido de silicio con dominio en forma de varilla.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras en la oscuridad para evitar el blanqueo de los colorantes fluorescentes y conservar las muestras a cuatro grados durante la incubación con el anticuerpo. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía confocal para responder preguntas adicionales sobre la localización intracelular de las nanopartículas.
Resumen
Este estudio se centra en la interacción de nanopartículas fluorescentes con subpoblaciones primarias de células inmunitarias utilizando citometría de flujo. El método permite la cuantificación de la internalización de nanopartículas en diversas células inmunitarias, proporcionando información sobre su comportamiento.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Inmunología
- Nanotecnología
- Citometría de flujo
Antecedentes
- Las nanopartículas pueden utilizarse para estudiar las interacciones entre células inmunitarias.
- La citometría de flujo ofrece ventajas frente a la microscopía para cuantificar la fluorescencia.
- Comprender la internalización de nanopartículas puede orientar estrategias terapéuticas.
- Diferentes tipos de células inmunitarias pueden presentar respuestas variables frente a las nanopartículas.
Objetivo del estudio
- Analizar la interacción de nanopartículas con subpoblaciones de células inmunitarias.
- Cuantificar las tasas de internalización de nanopartículas en diferentes tipos celulares.
- Mejorar la comprensión de las respuestas inmunitarias al tratamiento con nanopartículas.
Métodos Utilizados
- Las células inmunitarias primarias fueron tratadas con nanopartículas fluorescentes de dióxido de silicio.
- Las células fueron marcadas con anticuerpos específicos para análisis por citometría de flujo.
- Los ajustes de compensación se realizaron para tener en cuenta la interferencia de las nanopartículas.
- Se realizaron ensayos de internalización para evaluar la captación de nanopartículas.
Resultados principales
- Diferentes poblaciones de células inmunitarias mostraron tasas variables de internalización de nanopartículas.
- La citometría de flujo distinguió eficazmente entre tipos celulares según la intensidad de fluorescencia.
- Se confirmó la internalización mediante técnicas adicionales de microscopía.
- Los resultados indicaron una relación dependiente de la dosis en la captación de nanopartículas por monocitos.
Conclusiones
- El estudio demuestra la utilidad de la citometría de flujo para analizar las interacciones de nanopartículas con células inmunitarias.
- Los hallazgos contribuyen a comprender cómo las nanopartículas pueden influir en las respuestas inmunitarias.
- Investigaciones futuras podrían explorar aplicaciones terapéuticas de las nanopartículas en inmunología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la evaluación cuantitativa de la internalización de nanopartículas en subpoblaciones de células inmunitarias primarias, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en el desarrollo de nanoterapéuticos. Al proporcionar datos de captación dependientes de la dosis y específicos del tipo celular, aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento e informa las decisiones de avance o interrupción de intervenciones basadas en nanopartículas. El enfoque aborda un desafío clave en la etapa de descubrimiento: traducir las interacciones entre nanopartículas y células en métricas accionables y reproducibles para la priorización de carteras.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de la absorción de nanopartículas en subconjuntos inmunitarios, aclarando qué poblaciones celulares interactúan con los nanocarriers.
- Valor operativo: Permite la reducción de riesgos biológicos mediante la medición estandarizada y reproducible de la internalización a través de cambios en la intensidad de fluorescencia y en la dispersión lateral de la luz.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar tipos celulares con alta o baja afinidad por las nanopartículas, orientando la selección de dianas para nanoterapias inmunomoduladoras.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas de células inmunitarias validados para cribados posteriores mediante el establecimiento de perfiles de interacción basales con nanopartículas.
- Resultados cuantitativos: Genera mediciones de intensidad de fluorescencia y de dispersión lateral (SSC) que permiten obtener lecturas estandarizadas y comparables entre diferentes condiciones y puntos temporales.
- Reutilización de la plataforma: Permite flujos de trabajo de cribado escalables mediante protocolos consistentes de delimitación de poblaciones celulares, compensación y marcado con anticuerpos, aplicables a diversas formulaciones de nanopartículas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Se extiende a microglías primarias de ratones mutantes, permitiendo estudios con nanopartículas dirigidas al SNC en modelos inmunitarios relevantes para la enfermedad.
- Continuidad traslacional: Conecta los hallazgos de citometría de flujo con la confirmación mediante microscopía confocal, fortaleciendo la interpretación mecanicista para la validación preclínica.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de avance al revelar tasas diferenciales de internalización, como subpoblaciones de microglías GFP-positivas que muestran una absorción alterada de nanopartículas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la detección inicial de la interacción con el blanco hasta la evaluación mecanicista preclínica, especialmente para nanoterapias inmunomoduladoras en las que los perfiles de interacción con las células inmunitarias son fundamentales.
- Biología del descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la vinculación de la exposición a nanopartículas con cambios medibles en la granularidad celular y la fluorescencia, aclarando así los mecanismos de activación o modulación de células inmunitarias.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante pasos estandarizados de aislamiento, marcado y compensación que garantizan la cuantificación reproducible de las interacciones entre nanopartículas y células.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (intensidad de fluorescencia, desplazamientos en la dispersión lateral) que permiten comparar la internalización entre tipos celulares, concentraciones y puntos temporales.
- Investigación traslacional: Se conecta con la validación preclínica mediante confirmación ortogonal con microscopía confocal, alineándose así con la desactivación mecanicista guiada por biomarcadores.
- Reutilización en entornos empresariales: Funciona como una capacidad reutilizable en distintos formatos de nanopartículas (por ejemplo, FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) y modelos inmunitarios (leucocitos sanguíneos humanos, microglía murina), reduciendo el desarrollo metodológico redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar datos cuantitativos con resolución a nivel celular sobre la internalización de nanopartículas, mejorando la confianza en los objetivos de las estrategias inmunomoduladoras.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos de compensación y paneles de anticuerpos definidos, minimizando la variabilidad entre usuarios y centros.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al identificar tempranamente qué subpoblaciones inmunitarias tienen predisposición al contacto con nanopartículas, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas del desarrollo de nanoterapias.
- Impacto en la cartera: Permite una priorización ajustada al riesgo al destacar formulaciones de nanopartículas con perfiles favorables o desfavorables de interacción con células inmunitarias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la compensación de citometría de flujo, particularmente para abordar la interferencia en la dispersión lateral inducida por nanopartículas durante la corrección de superposición espectral.
- Depende del acceso a citómetros de flujo con capacidades de detección de fluorescencia y dispersión, junto con paneles de anticuerpos para la identificación de subpoblaciones de células inmunitarias.
- Necesita la estandarización entre equipos de estrategias de selección (gating) y ajustes de compensación para garantizar una interpretación de datos consistente entre grupos de descubrimiento y preclínicos.
- Requiere adaptación cuando se aplica a diferentes sistemas modelo (por ejemplo, células adherentes frente a no adherentes, células primarias humanas frente a murinas) para mantener la fidelidad del ensayo.
- Limitación práctica: las propiedades de fluorescencia o dispersión de las nanopartículas pueden interferir con ciertos fluorocromos, lo que requiere un diseño cuidadoso del panel y una validación de la compensación, como se indica en el protocolo.
