La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.

El objetivo general de este procedimiento es detectar las interacciones de nanopartículas fluorescentes con subpoblaciones de células inmunitarias primarias mediante citometría de flujo. Esto se logra tratando primero las células de interés con las nanopartículas. En el siguiente paso, las células se marcan con anticuerpos contra marcadores de superficie específicos de la célula y luego se analizan mediante citometría de flujo.

En última instancia, se puede medir la interacción de las nanopartículas con las poblaciones individuales de células inmunitarias. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la microscopía es que con esta técnica, las variaciones en las intensidades de fluorescencia inducidas por las nanopartículas se pueden cuantificar en poblaciones celulares no adherentes. Para la internalización de nanopartículas en leucocitos sanguíneos, o monocitos purificados, se comienza por la siembra de cinco veces 10 a la quinta parte de las células de interés en un mililitro por pocillo. En cada pocillo de una placa de 12 pocillos.

A continuación, añada 10 microlitros de suspensión de nanopartículas de dióxido de silicio fluorescente recién preparada a cada pocillo experimental, añadiendo un volumen igual de medio completo a los pocillos de control no tratados también en este momento. Después de una internalización de una hora a 37 grados Celsius, transfiera las muestras a tubos individuales de polipropileno de 1,5 mililitros, y luego centrifugue las muestras durante tres minutos a 6.000 veces G y temperatura ambiente para teñir las células con CD 14 a través de la incubación azul, 100 microlitros de cada suspensión celular en 10 microlitros del anticuerpo humano en una proporción de uno a 11 en tampón durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Después de lavar el anticuerpo no unido en un mililitro de tampón corriente, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón corriente fresco para el análisis de citometría de flujo.

A continuación, para configurar la compensación de desbordamiento espectral, abra el cuadro de configuración del instrumento en el software de citometría de flujo y, a continuación, adquiera una muestra libre de nanopartículas sin marcar con anticuerpos a baja velocidad fluida. Ajustar la configuración de compensación en presencia de nanopartículas fluorescentes es la parte más complicada del procedimiento, ya que las nanopartículas pueden interferir con la dispersión lateral para garantizar el éxito, se debe definir una puerta de la población celular de interés. Ajuste manualmente la dispersión frontal y lateral regulando los canales de voltaje. A continuación, dibuje una puerta adecuadamente grande alrededor de la población de células deseada.

Cargue otra muestra sin etiquetar y abra la pestaña de compensación en el cuadro de configuración del instrumento. Ajuste el factor de compensación durante la adquisición hasta que la intensidad de fluorescencia en el canal de desbordamiento sea aproximadamente la misma para las poblaciones de fluorocromo positivo y negativo. Finalmente, después de ajustar la compensación para cada tubo de control de fluorocromo teñido, leídas las muestras tratadas con nanopartículas en un esfuerzo por caracterizar mejor el comportamiento de los glóbulos blancos en respuesta a las nanopartículas, se realizaron ensayos de internalización como se acaba de demostrar.

Por ejemplo, en este experimento representativo, se identificaron claramente tres subpoblaciones principales de leucocitos sanguíneos mediante la dispersión frontal y lateral después del aislamiento de PBMC. Además, después del tratamiento con dióxido de silicio fz, los linfocitos, monocitos y granulocitos exhibieron diferentes tasas de internalización de nanopartículas como lo indica su intensidad de fluorescencia. En estas imágenes, se demuestra la internalización de nanopartículas en monocitos primarios CD 14 positivos purificados a partir de pbmc.

Estos diagramas de dispersión muestran monocitos CD 14 positivos en presencia de nanopartículas de dióxido de silicio de Fitz. El histograma ilustra la cuantificación de las células fitzy positivas expresadas como intensidad de fluorescencia. Se realizaron experimentos de internalización similares con monocitos TP one tratados con concentraciones crecientes de nanopartículas de dióxido de silicio de Fitz con células no tratadas como control negativo.

Los diagramas de puntos ilustran el aumento dependiente de la dosis en la dispersión lateral con una dispersión directa sin cambios en la TP una línea celular después de la internalización de nanopartículas. Los datos de estos gráficos sugieren que el tratamiento con nanopartículas de dióxido de silicio de fitz induce una internalización dependiente de la dosis en monocitos destacada por la mejora de la granularidad intracelular para obtener más información sobre las interacciones entre las células inmunitarias y las nanopartículas, las microglías se cultivaron durante siete días in vitro y se incubaron con nanopartículas durante una hora. La microscopía de fluorescencia indicó un cultivo mixto de células gliales primarias con un gran número de astrocitos no adherentes GFP negativos y algunas células GFP positivas.

En este experimento representativo, se pudieron distinguir tres subpoblaciones gliales por citometría de flujo con un solo anticuerpo CD 11 B que teñió CD 11 B, astrocitos negativos GFP negativos y otras células gliales, células negativas CD-11 B GLP positivas y una subpoblación CD 11 B positiva para GFP Las dos últimas subpoblaciones son capaces de internalizar nanopartículas con una deficiencia ligeramente aumentada por la población positiva para GFP. La internalización de nanopartículas se puede verificar aún más mediante microscopía confocal, como se demuestra en esta imagen, utilizando nanopartículas de dióxido de silicio de varilla dominada.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras en la oscuridad para evitar el blanqueamiento de los tintes fluorescentes y mantener las muestras a cuatro grados durante la incubación de anticuerpos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía confocal para responder a preguntas adicionales sobre la localización intracelular de las nanopartículas.