La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo
28 de marzo de 2014
Análisis de la interacción de nanopartículas con subpoblaciones definidas de células inmunes por citometría de flujo.
El objetivo general de este procedimiento es detectar las interacciones de nanopartículas fluorescentes con subpoblaciones de células inmunitarias primarias mediante citometría de flujo. Esto se logra tratando primero las células de interés con las nanopartículas. En el siguiente paso, las células se marcan con anticuerpos contra marcadores de superficie específicos de la célula y luego se analizan mediante citometría de flujo.
En última instancia, se puede medir la interacción de las nanopartículas con las poblaciones individuales de células inmunitarias. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la microscopía es que con esta técnica, las variaciones en las intensidades de fluorescencia inducidas por las nanopartículas se pueden cuantificar en poblaciones celulares no adherentes. Para la internalización de nanopartículas en leucocitos sanguíneos, o monocitos purificados, se comienza por la siembra de cinco veces 10 a la quinta parte de las células de interés en un mililitro por pocillo. En cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
A continuación, añada 10 microlitros de suspensión de nanopartículas de dióxido de silicio fluorescente recién preparada a cada pocillo experimental, añadiendo un volumen igual de medio completo a los pocillos de control no tratados también en este momento. Después de una internalización de una hora a 37 grados Celsius, transfiera las muestras a tubos individuales de polipropileno de 1,5 mililitros, y luego centrifugue las muestras durante tres minutos a 6.000 veces G y temperatura ambiente para teñir las células con CD 14 a través de la incubación azul, 100 microlitros de cada suspensión celular en 10 microlitros del anticuerpo humano en una proporción de uno a 11 en tampón durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Después de lavar el anticuerpo no unido en un mililitro de tampón corriente, vuelva a suspender las células en 200 microlitros de tampón corriente fresco para el análisis de citometría de flujo.
A continuación, para configurar la compensación de desbordamiento espectral, abra el cuadro de configuración del instrumento en el software de citometría de flujo y, a continuación, adquiera una muestra libre de nanopartículas sin marcar con anticuerpos a baja velocidad fluida. Ajustar la configuración de compensación en presencia de nanopartículas fluorescentes es la parte más complicada del procedimiento, ya que las nanopartículas pueden interferir con la dispersión lateral para garantizar el éxito, se debe definir una puerta de la población celular de interés. Ajuste manualmente la dispersión frontal y lateral regulando los canales de voltaje. A continuación, dibuje una puerta adecuadamente grande alrededor de la población de células deseada.
Cargue otra muestra sin etiquetar y abra la pestaña de compensación en el cuadro de configuración del instrumento. Ajuste el factor de compensación durante la adquisición hasta que la intensidad de fluorescencia en el canal de desbordamiento sea aproximadamente la misma para las poblaciones de fluorocromo positivo y negativo. Finalmente, después de ajustar la compensación para cada tubo de control de fluorocromo teñido, leídas las muestras tratadas con nanopartículas en un esfuerzo por caracterizar mejor el comportamiento de los glóbulos blancos en respuesta a las nanopartículas, se realizaron ensayos de internalización como se acaba de demostrar.
Por ejemplo, en este experimento representativo, se identificaron claramente tres subpoblaciones principales de leucocitos sanguíneos mediante la dispersión frontal y lateral después del aislamiento de PBMC. Además, después del tratamiento con dióxido de silicio fz, los linfocitos, monocitos y granulocitos exhibieron diferentes tasas de internalización de nanopartículas como lo indica su intensidad de fluorescencia. En estas imágenes, se demuestra la internalización de nanopartículas en monocitos primarios CD 14 positivos purificados a partir de pbmc.
Estos diagramas de dispersión muestran monocitos CD 14 positivos en presencia de nanopartículas de dióxido de silicio de Fitz. El histograma ilustra la cuantificación de las células fitzy positivas expresadas como intensidad de fluorescencia. Se realizaron experimentos de internalización similares con monocitos TP one tratados con concentraciones crecientes de nanopartículas de dióxido de silicio de Fitz con células no tratadas como control negativo.
Los diagramas de puntos ilustran el aumento dependiente de la dosis en la dispersión lateral con una dispersión directa sin cambios en la TP una línea celular después de la internalización de nanopartículas. Los datos de estos gráficos sugieren que el tratamiento con nanopartículas de dióxido de silicio de fitz induce una internalización dependiente de la dosis en monocitos destacada por la mejora de la granularidad intracelular para obtener más información sobre las interacciones entre las células inmunitarias y las nanopartículas, las microglías se cultivaron durante siete días in vitro y se incubaron con nanopartículas durante una hora. La microscopía de fluorescencia indicó un cultivo mixto de células gliales primarias con un gran número de astrocitos no adherentes GFP negativos y algunas células GFP positivas.
En este experimento representativo, se pudieron distinguir tres subpoblaciones gliales por citometría de flujo con un solo anticuerpo CD 11 B que teñió CD 11 B, astrocitos negativos GFP negativos y otras células gliales, células negativas CD-11 B GLP positivas y una subpoblación CD 11 B positiva para GFP Las dos últimas subpoblaciones son capaces de internalizar nanopartículas con una deficiencia ligeramente aumentada por la población positiva para GFP. La internalización de nanopartículas se puede verificar aún más mediante microscopía confocal, como se demuestra en esta imagen, utilizando nanopartículas de dióxido de silicio de varilla dominada.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las muestras en la oscuridad para evitar el blanqueamiento de los tintes fluorescentes y mantener las muestras a cuatro grados durante la incubación de anticuerpos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía confocal para responder a preguntas adicionales sobre la localización intracelular de las nanopartículas.
Visión general
Este estudio se centra en la interacción de nanopartículas fluorescentes con subpoblaciones de células inmunes primarias mediante citometría de flujo. El método permite la cuantificación de la internalización de nanopartículas en varios tipos de células inmunes, proporcionando información sobre su comportamiento.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Nanotecnología
- Citometría de flujo
Antecedentes
- Las nanopartículas pueden usarse para estudiar las interacciones de las células inmunes.
- La citometría de flujo ofrece ventajas sobre la microscopía para cuantificar la fluorescencia.
- Comprender la internalización de nanopartículas puede informar estrategias terapéuticas.
- Diferentes tipos de células inmunes pueden exhibir respuestas variadas a las nanopartículas.
Propósito del estudio
- Analizar la interacción de las nanopartículas con las subpoblaciones de células inmunes.
- Cuantificar las tasas de internalización de nanopartículas en diferentes tipos de células.
- Mejorar la comprensión de las respuestas inmunes al tratamiento con nanopartículas.
Métodos utilizados
- Las células inmunes primarias fueron tratadas con nanopartículas fluorescentes de dióxido de silicio.
- Las células fueron marcadas con anticuerpos específicos para el análisis por citometría de flujo.
- Los ajustes de compensación se ajustaron para tener en cuenta la interferencia de las nanopartículas.
- Se realizaron ensayos de internalización para evaluar la captación de nanopartículas.
Principales resultados
- Diferentes poblaciones de células inmunes mostraron tasas variables de internalización de nanopartículas.
- La citometría de flujo distinguió eficazmente entre tipos celulares basados en la intensidad de fluorescencia.
- La internalización se confirmó mediante técnicas adicionales de microscopía.
- Los resultados indicaron una relación dependiente de la dosis en la captación de nanopartículas por los monocitos.
Conclusiones
- El estudio demuestra la utilidad de la citometría de flujo en el análisis de las interacciones de las nanopartículas con las células inmunes.
- Los hallazgos contribuyen a comprender cómo las nanopartículas pueden influir en las respuestas inmunes.
- Investigaciones adicionales pueden explorar aplicaciones terapéuticas de nanopartículas en inmunología.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables quantitative assessment of nanoparticle internalization in primary immune cell subpopulations, supporting target validation and mechanistic de-risking in nanotherapeutic development. By providing dose-dependent and cell-type-specific uptake data, it enhances predictive confidence in early discovery and informs go/no-go decisions for nanoparticle-based interventions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: translating nanoparticle-cell interactions into actionable, reproducible metrics for portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying nanoparticle uptake across immune subsets, clarifying which cell populations engage with nanocarriers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, reproducible measurement of internalization via fluorescence intensity and side-scattered light shifts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell types with high or low nanoparticle affinity, guiding target selection for immunomodulatory nanotherapies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated immune cell systems for downstream screening by establishing baseline nanoparticle interaction profiles.
- Quantitative Outputs: Generates fluorescence intensity and SSC metrics that enable standardized, comparable readouts across conditions and time points.
- Platform Reuse: Supports scalable screening workflows through consistent gating, compensation, and antibody labeling protocols applicable to diverse nanoparticle formulations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Extends to primary microglia from mutant mice, enabling CNS-targeted nanoparticle studies in disease-relevant immune models.
- Translational Continuity: Connects flow cytometry findings to confocal microscopy confirmation, strengthening mechanistic interpretation for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs advancement decisions by revealing differential internalization rates, such as GFP-positive microglial subpopulations showing altered nanoparticle uptake.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target engagement screening to preclinical mechanistic evaluation, particularly for immunomodulatory nanotherapies where immune cell interaction profiles are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking nanoparticle exposure to measurable changes in cell granularity and fluorescence, clarifying mechanisms of immune cell activation or modulation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized isolation, labeling, and compensation steps that ensure reproducible quantification of nanoparticle-cell interactions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity, SSC shifts) that enable comparison of internalization across cell types, concentrations, and time points.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via orthogonal confirmation with confocal microscopy, aligning with biomarker-aligned mechanistic de-risking.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across nanoparticle formats (e.g., FITC-SiO₂, Rhodamine-SiO₂) and immune models (human blood leukocytes, murine microglia), reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by delivering cell-resolved, quantitative data on nanoparticle internalization, improving target confidence in immunomodulatory strategies.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined compensation protocols and antibody panels, minimizing variability across users and sites.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early which immune subsets are prone to nanoparticle engagement, reducing late-stage biological risk in nanotherapeutic development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by highlighting nanoparticle formulations with favorable or undesirable immune cell interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, particularly to address nanoparticle-induced side-scattering interference during spectral overlap correction.
- Dependent on access to flow cytometers with fluorescence and scatter detection capabilities, along with antibody panels for immune cell subset identification.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and compensation settings to ensure consistent data interpretation between discovery and preclinical groups.
- Requires adaptation when applied to different model systems (e.g., adherent vs. non-adherent cells, human vs. murine primary cells) to maintain assay fidelity.
- Practical limitation: Nanoparticle fluorescence or scatter properties may interfere with certain fluorochromes, requiring careful panel design and compensation validation as noted in the protocol.
