Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

Resumen

Proteínas de la superficie celular son biológicamente importantes y ampliamente glicosilada. Presentamos aquí un enfoque glucopéptidos captura para solubilizar, enriquecer y deglycosylate estas proteínas para análisis proteómicos fáciles LC-MS basados.

Resumen

Proteínas de superficie celular, incluyendo las proteínas de la matriz extracelular, participan en todos los principales procesos y funciones celulares, tales como el crecimiento, la diferenciación y la proliferación. Una caracterización completa de estas proteínas proporciona una rica información para el descubrimiento de biomarcadores, la identificación del tipo de célula, y la selección de medicamentos-objetivo, así como ayudar a avanzar en nuestra comprensión de la biología celular y fisiología. Proteínas de superficie, sin embargo, plantean desafíos analíticos significativos, debido a su inherente baja abundancia, alta hidrofobicidad, y las modificaciones posteriores a la traducción pesados. Tomando ventaja de la glicosilación prevalente en proteínas de la superficie, se introduce aquí un enfoque glicopéptido de captura de alto rendimiento que integra las ventajas de varios medios N-glycoproteomics existentes. Nuestro método puede enriquecer los glicopéptidos derivados de proteínas de la superficie y retire sus glicanos para proteómica fáciles utilizando LC-MS. La N-glicoproteoma resuelto comprende la información de la identidad y la cantidad de proteínas, así como sus sitios de glicosilación. Este método se ha aplicado a una serie de estudios en áreas que incluyen el cáncer, las células madre, y la toxicidad del fármaco. La limitación del método radica en la baja abundancia de proteínas de la membrana de superficie, de tal manera que se requiere una cantidad relativamente grande de muestras para este análisis en comparación con estudios centrados en las proteínas citosólicas.

Introducción

Proteínas de superficie celular interactúan con el medio ambiente extracelular y transmiten señales desde el exterior al interior de una célula. Por lo tanto, estas proteínas, incluyendo las proteínas de la matriz extracelular, desempeñan papeles críticos en todos los aspectos de la biología celular y la fisiología que van desde la proliferación, el crecimiento, la migración, la diferenciación al envejecimiento y así sucesivamente. Proteínas de superficie funcionan mediante la interacción con otras células, proteínas y moléculas pequeñas ^1-3. La caracterización molecular de las proteínas de la superficie celular es de gran interés no sólo para los biólogos....

Protocolo

1. Cosecha Membranas

1. Añadir tampón hipotónico (Tris-HCl 10 mM, KCl 10, 1,5 mM de MgCl _2, pH 8,0) con un cóctel inhibidor de la proteasa en un sedimento de células (~ 10 ⁸ células) y se incuba durante 15-30 min en hielo. Lisar las células haciendo pasar la muestra a través de agujas de jeringa (5-10 pasadas) o la homogeneización de la muestra por un homogeneizador Dounce (15-30 golpes). Utilice un hemocitómetro y tinción con azul de tripano para comprobar la eficiencia de la lisis.
2. Obtener la fracción microsomal por una centrifugación diferencial del lisado a 3.000 gx 15 min y después a 100 000 gx 2 h. La primera centrifugaci....

Resultados

Un diagrama de flujo representativo del procedimiento experimental se resume en la figura 1. El etiquetado y otras etapas de fraccionamiento son opcionales y detalles se describen en una publicación reciente ^18. Otra opción es analizar los péptidos no modificados, que no reaccionan con la resina. Las ventajas de análisis de los péptidos no modificados incluyen el potencial de identificación de péptidos y proteínas no glicosiladas, tales como claudinas en uniones estrechas; Una ventaja adicion.......

Discusión

Aquí presentamos una estrategia glucopéptidos captura para perfilar las proteínas de la superficie celular. El método se puede aplicar para estudiar las proteínas secretadas, tales como los de la sangre, así como en otros fluidos corporales o en medios de cultivo celular.

El éxito del método se basa en la digestión completa de las muestras; por lo tanto, una caracterización de SDS-PAGE de la eficiencia de la digestión es necesario, especialmente para el análisis por primera vez de una muestr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
TDT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Yodoacetamida	Sigma	A3221
Rapigest SF	Aguas	186001860
Periodato de sodio	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Gel de hidrazida Affi-Gel Hz	Bio-Rad	153-6047
Tripsina		Worthington Cartucho LS02115 Biomedical
		Sep-Pak C-18	Waters
Oasis MCX	186000252		Waters
Inhibidor de la proteasa	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sulfito de sodio	Caledon	8360-1
Invertasa	Sigma	I0408
α-1 tripsina	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovoalbúmina	Sigma	A5503
Conalbúmina	Sigma	C0755

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